Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie eksperymentu z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA. Jest to realizowane poprzez najpierw pozyskanie nadruków szkiełek mikromacierzowych zawierających bibliotekę sond mikroRNA oraz przygotowanie próbek RNA o odpowiedniej jakości i ilości. Następnie próbki RNA i kontrolowana próbka DNA są znakowane barwnikami fluorescencyjnymi.

Następnie znakowane kwasy nukleinowe są dodawane do płytki mikroarray w celu hybrydyzacji. Na koniec płytka mikroarray jest płukana, skanowana i regenerowana. W rezultacie można uzyskać dane obrazujące ekspresję microRNA w całym genomie poprzez analizę intensywności hybrydyzacji poszczególnych sond microRNA na płytce.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie ekspresji genów, takie jak wpływ normalnych warunków fizjologicznych lub stanów patologicznych na ekspresję mikroRNA w skali globalnej. Jakość wykonania macierzy mikroarray jest jednym z krytycznych czynników warunkujących sukces eksperymentu. Po wyizolowaniu RNA metodą zachowującą małe RNA i ponownym zawieszeniu go w stężeniu równym lub wyższym niż 2 mg/mL, należy znakować RNA w objętości reakcyjnej 20 µL, mieszając początkowo około 25 µg całkowitego RNA z 0,5 µg 5' P-C-U-D-Y 5 4 7 3' w buforze 1X HEPs uzupełnionym o T4 RNA Ligase 1D TT oraz ATP. Jeśli dostępna jest mniejsza ilość RNA, należy proporcjonalnie zmniejszyć ilość RNA oraz objętość reakcji.

Jeśli RNA jest bardzo rozcieńczone, należy dodać nośnik, taki jak tRNA drożdżowy, aby wspomóc precypitację, a następnie inkubować reakcję na lodzie w lodówce od 2 do 24 godzin. Następnie należy dodać octan sodu do stężenia 0,3 M, a potem trzy objętości etanolu i precypitować RNA przez noc w temperaturze -20 °C. Przy pierwszym użyciu szkiełek należy przeprowadzić prehybrydyzację w przefiltrowanym roztworze 3 XSSC, 0,1% SDS i 0,2% BSA przez 30 do 60 minut w temperaturze 37 °C.

Następnie zanurz preparaty kilka razy w wodzie. Potem w izopropanolu, a następnie wysusz preparaty w wirówce z adapterem do szkiełek przedmiotowych przy 100 ×g przez pięć minut w temperaturze 22 °C. Opłucz paski do podnoszenia w wodzie.

Następnie, przed suszeniem na powietrzu w etanolu, umieść szkiełko wewnątrz podstawy komory do hybrydyzacji mikroarrayów, a na szkiełku płytkę dystansową w taki sposób, aby zakrywała ona obszar sond oraz białe paski. W ciemności dociśnij szkiełko, odwiruj osadzone znakowane RNA, przemyj je raz 70% etanolu i wysusz osad na powietrzu. Osad powinien mieć czerwonkawy kolor.

Przygotuj roztwór do hybrydyzacji, stosując od 1/15 do 1/100 objętości oczyszczonego znakowanego referencyjnego DNA na każdą próbkę RNA. Całkowicie rozpuść osad RNA w około 60 µl roztworu do hybrydyzacji, aby zapobiec wyschnięciu roztworu. Podczas inkubacji dodaj 20 µl wody do każdego z otworów nawilżających w podstawie komory hybrydyzacyjnej mikromacierzy.

Nanieś mieszaninę znakowanego RNA i referencyjnego DNA na szkiełko. Za pomocą cienkiej końcówki pipety delikatnie dotknij krawędzi szkiełka przykrywnego i poprzez ssanie doprowadź do wprowadzenia roztworu w przestrzeń między szkiełkiem przykrywnym a podstawowym.

Umieść pokrywę komory hybrydyzacyjnej na podstawie. Następnie zamknij komorę za pomocą metalowych zacisków. Włóż całą komorę do plastikowej torebki dołączonej do kasety komory.

Na koniec umieść kasetę komorową w pojemniku z mokrym ręcznikiem papierowym. Następnie przykryj pojemnik folią spożywczą i umieść go w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37°C na około 24 godziny. Aby przetworzyć preparaty po hybrydyzacji, rozmontuj kasety komorowe jedna po drugiej i zanurz slajd wraz z szybką przykrywającą w 2XSSC w temperaturze 22°C.

Podkładka do przesuwania samoczynnie oddzieli się od szkiełka; należy przemyć szkiełka dwukrotnie w 0,8 XSSC, a następnie trzykrotnie w 0,4 XSSC, tak aby całkowity czas płukania wynosił od jednej do dwóch minut. Osuszyć szkiełka za pomocą wirówki z adapterem do szkiełek. Następnie należy zeskanować szkiełka skanerem do mikromacierzy i użyć programu takiego jak Blue Fuse w celu kwantyfikacji intensywności w plikach obrazów.

Zbadaj poszczególne plamki, aby wykluczyć plamki anormalne, które zazwyczaj powstają w wyniku drukowania płytek porowych lub manipulowania płytkami po hybrydyzacji. Do analizy i prezentacji danych wykorzystaj programy takie jak gene springing oraz excel w celu ponownego wykorzystania mikromacierzy. Usuń hybrydyzaty z płytki, płucząc ją w wodzie, a następnie zanurzając w kuwecie barwiącej z uprzednio podgrzanym 1 mM NaOH oraz 0,1 XSSC w temperaturze 62 °C przez 10 do 20 minut.

Powtórz inkubację po raz drugi. Przemyj preparaty kilka razy w wodzie przez maksymalnie 60 minut, delikatnie wstrząsając przy temperaturze 22 °C. Osusz preparaty za pomocą wirówki i przechowuj w temperaturze 22 °C.

Preparaty można wykorzystać bez wstępnej hybrydyzacji. Rycina przedstawia zeskanowany obraz mikromacierzy wykazujący bardzo precyzyjne i silne sygnały hybrydyzacyjne. Czerwone plamki są wynikiem hybrydyzacji referencyjnego DNA, zielone plamki pochodzą z próbki RNA znakowanej DY 5 47, a plamki żółte powstały w wyniku hybrydyzacji zarówno DNA, jak i RNA do tych samych sond.

Współczynniki korelacji Pearsona pomiędzy powtórzeniami technicznymi hybrydyzacji mikromacierzy wynoszą około 0,99, co wskazuje na doskonałą powtarzalność. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania niestandardowego eksperymentu z użyciem mikromacierzy, nie tylko w celu ilościowego oznaczenia mikronukleaz, ale także innych rodzajów kwasów nukleinowych, takich jak mRNA.