Wizualizacja indukowanych promieniami UV produktów pośrednich replikacji w E. coli przy użyciu dwuwymiarowej elektroforezy w żelu agarozowym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja pośrednich struktur DNA powstających podczas napotkania przez replikację uszkodzeń DNA, z wykorzystaniem dwuwymiarowej analizy żelowej. Osiąga się to poprzez wstępną izolację DNA z aktywnie dzielących się komórek, w których wyindukowano uszkodzenia blokujące replikację. Następnie wykorzystuje się elektroforezę żelową do rozdzielenia odzyskanego DNA na podstawie jego wielkości.

Następnie ścieżki są wycinane i odlewane poziomo w drugim żelu, który dodatkowo rozdziela DNA w zależności od jego rozmiaru i kształtu. Na koniec stosuje się analizę southern, aby zwizualizować struktury DNA powiązane z replikującymi się fragmentami DNA w czasie przed oraz w różnych odstępach czasu po wprowadzeniu uszkodzeń indukowanych promieniami UV. Ostatecznie procedura ta może służyć do wykazania, że brak możliwości naprawy uszkodzeń DNA u niektórych mutantów prowadzi do akumulacji produktów pośrednich naprawy DNA.

Cześć, nazywam się Arthur Ian. Pochodzę z laboratorium Corella na Portland State University. Cześć, nazywam się Brand she, ja również pochodzę z laboratorium Corella.

Dzisiaj przedstawimy procedurę dwuwymiarowej elektroforezy żelowej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania produktów pośrednich replikacji i naprawy DNA. Zacznijmy zatem.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 200 µL nocnej hodowli e coli zawierającej plazmid PBR 3 22 w pożywce DGC thigh z ampicyliną w temperaturze 37 °C. Zastosowanie pożywki DGC thigh minimalizuje ekranowanie UV. Po nocnej inkubacji komórki należy odwirCować przy 14 000 RPM przez 30 sekund.

Następnie osad komórkowy resuspenduj w 200 µL medium DG C bez ampicyliny i zaszczep. Hodowle w 20 mL medium DG C prowadź bez selekcji ampicyliną w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C do osiągnięcia OD 600 równej 0,5, co odpowiada około 5 × 10⁸ komórkom na ml. Hodowla bez ampicyliny pozwala uniknąć selekcji przeciwko nieprawidłowym lub nieproduktywnym produktom pośrednim replikacji, które mogą pojawić się u niektórych mutantów.

Dodatkowo, w przypadku stosowania światła UV do indukowania uszkodzeń, konieczne jest usunięcie ampicyliny z pożywki, ponieważ silnie pochłania ona promieniowanie o tych długościach fal i tworzy osłonę. Komórki redukują efektywną dawkę UV podczas wzrostu. Należy użyć fotometru UVC, aby wyznaczyć odległość od lampy bakteriobójczej o mocy 15 watów, która zapewnia natężenie ekspozycji wynoszące około jednego JUUL na metr kwadratowy na sekundę.

Kolejne kroki należy przeprowadzić w świetle żółtym, aby zapobiec fotoreaktywacyjnej odwracalności dimerów cyklobutanowych peryden przez fotoliazę po naświetlaniu UV. Po osiągnięciu pożądanej gęstości komórek, za pomocą pipety przenieść kulturę do szalki Petriego o średnicy 15 cm umieszczonej na platformie obrotowej, aby zapewnić równomierne naświetlenie całej populacji komórek. Następnie naświetlić kultury dawką 50 J/m² i natychmiast przenieść je do sterylnej, uprzednio ogrzanej kolby, a następnie umieścić z powrotem w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 37 °C.

Przez cały czas trwania eksperymentu dawka ta powoduje powstanie średnio jednego dimeru cyklobutanowego co 4,5 kilobazy jednoniciowego DNA dla każdego badanego punktu czasowego. Przenieś pipetą 0,75 mililitra alikwotu hodowli do 0,75 mililitra schłodzonego w lodzie buforu net 30. Bufor net 30 służy jako bufor zatrzymujący, który zapobiega zachodzeniu replikacji oraz naprawy przez wycinanie nukleotydów.

Po dodaniu buforu zatrzymującego próbkę można przechowywać w lodzie do końca przebiegu czasowego. Po zakończeniu przebiegu czasowego należy odwirować każdą próbkę i resuspender osady. W 150 µL buforu do lizy należy przeprowadzić lizę komórek w temperaturze 37 °C przez 20 minut bez mieszania.

Ponieważ replikowane struktury z regionami jednoniciowymi lub punktami rozgałęzień są bardziej podatne na ścinanie, należy odciąć końcówki pipet żyletką, aby poszerzyć ich otwór i zminimalizować siły ścinające. Generalnie należy ograniczyć pipetowanie i mieszanie do minimum, aż do momentu trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi; po lizie należy dodać proteinazę K i SDS, a następnie kontynuować inkubację przez jedną godzinę. Służy to uwolnieniu fragmentów DNA związanych z białkami.

Ponieważ aktywnie replikowane DNA często jest związane z kompleksami białkowymi lub błonowymi, pomaga to zwiększyć wydajność uzyskiwania fragmentów replikacyjnych. Po jednej godzinie wyodrębnij próbki, dodając do każdej z nich dwie objętości fenolu i delikatnie odwracając probówki przez pięć minut. Następnie dodaj dwie objętości chloroformu i alkoholu izoamylowego, a następnie delikatnie odwracaj probówki przez kolejne pięć minut.

Następnie odwiruj próbki w mikrocentryfudze przy 14 000 RPM przez pięć minut i przenieś górną fazę wodną z każdej próbki do nowej probówki. Następnie dodaj cztery objętości izopropanolu z chloroformem i ponownie delikatnie odwracaj probówki przez pięć minut. Ponownie odwiruj próbki przy 14 000 RPM przez pięć minut.

Umieść membranę dializacyjną na 250 mililitrach 0.1 xte w zlewce i nanieś 100 mikrolitrów każdej próbki na membranę. Pozostaw próbki do dializy na jedną godzinę po rozpoczęciu procesu. Przenieś 80 mikrolitrów każdej próbki do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra zawierającej 20 mikrolitrów mieszaniny enzymatycznej.

Próbki inkubować w celu trawienia przez noc w temperaturze 37 °C. Enzym PV two linearyzuje plazmid bezpośrednio za miejscem początku replikacji. Przed nałożeniem na żel agarozowy dodać 100 µL chloroformu oraz 20 µL 6x barwnika do nakładania próbek zawierającego bromofenol błękitny.

Dodaj błękit fenolowy i cyjan ksylenowy do każdej próbki i wymieszaj; chloroform usunie wszelki pozostały PV two związany z końcami DNA. Rozpocznij dwuwymiarową analizę żelu agarozowego, przeprowadzając próbki z trawionym DNA przez pierwszy wymiar. Najpierw nałóż marker wielkości Lambda hind three do pierwszej studni wcześniej przygotowanego żelu agarozowego 0,4% w 1XTBE.

Następnie nanieś 40 µL fazy wodnej zawierającej barwnik do nakładania dla każdej próbki, pomijając niektóre ścieżki, aby ułatwić późniejsze wycinanie żelu. Po elektroforezie przeprowadź pierwszy wymiar przy napięciu 1 V/cm przez około 12 do 15 godzin. Niskie napięcie oraz żel AGROS o niskim stężeniu procentowym służą do rozdzielania fragmentów DNA głównie na podstawie ich wielkości.

Po zakończeniu elektroforezy w pierwszym wymiarze, za pomocą dużego noża kuchennego wytnij pierwszą ścieżkę zawierającą marker Lambda Hind III i przeprowadź barwienie bromkiem etydinium. W celu przygotowania drugiego wymiaru, wytnij ścieżki żelu dużym nożem kuchennym, posługując się markerem Lambda Hind III jako wzorcem, a następnie odetnij i odrzuć obszar poniżej miejsca, w którym w każdej ścieżce spodziewany jest prążek zlinearyzowanego plazmidu. Aby odlać żel do drugiego wymiaru, umieść każdy wycinek poziomo na górnej krawędzi pustej formy do żelu.

Przygotować roztwór 1% AROS w buforze XTBE i schłodzić go do 55 stopni Celsjusza. Po schłodzeniu wlać roztwór żelu, aby odlać drugi wymiar, upewniając się, że plasterki żelu są całkowicie przykryte. Przed wlewaniem żelu należy upewnić się, że plasterki są równomiernie zorientowane, a kasetka do odlewania znajduje się w poziomie.

Po zestaleniu się żelu przeprowadź elektroforezę w drugim wymiarze przez pięć i pół do siedmiu godzin przy napięciu 6,5 V/cm w aparacie elektroforetycznym z recyrkulacją buforu. Wysokie napięcie oraz wysoki procentowy stężenie żelu Agros skutecznie rozdzielają fragmenty DNA w zależności od ich kształtu oraz wielkości. Fragmenty o nieliniowym kształcie przemieszczają się wolniej w drugim wymiarze podczas elektroforezy. Przepłucz żel raz w wodzie, a następnie przemyj go dwukrotnie w 400 ml 0,25 M kwasu solnego przez 15 minut przy łagodnym wytrząsaniu.

Płukanie kwasem służy do częściowego nacinania cząsteczek DNA na mniejsze fragmenty, które przenoszą się wydajniej podczas analizy Southern; jest to konieczne ze względu na duży rozmiar i nietypowy kształt produktów pośrednich replikacji DNA. Aby przygotować żel do transferu alkalicznego, ponownie wypłucz żel w wodzie, a następnie przemyj go dwukrotnie w 400 mililitrach 0,4 molarnego wodorotlenku sodu przez 30 minut. Następnie DNA z żeli przenosi się na membranę nylonową high bond n plus, stosując system transferu alkalicznego w dół z użyciem 0,4 molarnego wodorotlenku sodu, zgodnie z opisem w pisemnej części tej procedury; proces transferu DNA powinien trwać od 6 do 12 godzin. Po zakończeniu transferu DNA należy przejść do hybrydyzacji z sondą, zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Po przeprowadzeniu inkubacji z przeciwciałami i przemyciu błony, należy położyć ją na ręczniku papierowym, aż ciecz widocznie odparuje. Następnie błonę należy zawinąć w folię z polichlorku winylu i naświetlić na ekranie fosforyzatora. Na koniec radioaktywność można wizualizować i kwantyfikować przy użyciu systemu Storm 840 oraz powiązanego oprogramowania ImageQuant.

Przedstawiono schemat wzoru migracji dwóch trawionych plazmidów PBR 3 22 obserwowanego podczas analizy żelowej 2D. Niereplikujące się plazmidy liniowe migrują jako liniowe fragmenty 4.4 KB, natomiast plazmidy replikujące tworzą struktury w kształcie litery Y, które migrują wolniej niż fragmenty niereplikujące ze względu na większy rozmiar i nieliniowy kształt. Wzór migracji ten tworzy łuk wybiegający z obszaru liniowego w stronę studzienki po napromieniowaniu UV.

Cząsteczki w kształcie podwójnego Y lub X są obserwowane w obszarze stożka i migrują wolniej niż łuk cząsteczek w kształcie Y. Przykład analizy południowej żelu 2D sondowanego P 32 znakowanym PBR 3 22 przedstawiono dla komórek bezpośrednio po napromieniowaniu UV oraz 15 minut po napromieniowaniu UV bezpośrednio po napromieniowaniu UV. Około 1% całkowitego plazmidowego DNA można znaleźć w łuku Y, gdy komórki szybko rosną w fazie wykładniczej po napromieniowaniu.

Przejściowy wzrost liczby cząsteczek w kształcie litery Y obserwuje się w momencie gromadzenia się zablokowanych widełek replikacyjnych w miejscach uszkodzeń. Intermediaty replikacyjne w kształcie litery L również gromadzą się przejściowo i utrzymują do czasu skorelowanego z naprawą uszkodzeń. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wizualizacji intermediatów naprawy DNA z wykorzystaniem dwuwymiarowej elektroforezy w żelu.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby mieć na uwadze siły ścinające, które mogą obniżyć wydajność, oraz zachować ostrożność w obchodzeniu się ze wszystkimi próbkami i żelami. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.