Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest nieinwazyjne monitorowanie w czasie rzeczywistym zmian metabolicznych na poziomie całego organizmu w obrębie glikolizy, metabolizmu pirogronianu oraz cyklu kwasu trójkarboksylowego, wywołanych przez poszczególne szlaki metaboliczne, zmiany genetyczne i/lub leczenie farmakologiczne. Osiąga się to poprzez podawanie izotopów trwałych żywym nicieniom, aby zapewnić wystarczające wzbogacenie izotopowe większej liczby metabolitów, co umożliwia ilościowe określenie zmian genetycznych i/lub farmakologicznych w pośrednich szlakach metabolicznych. W drugim kroku, za pomocą spektrometrii mas stosunków gazowych, mierzy się wbudowanie izotopów w atmosferyczny i rozpuszczony dwutlenek węgla, co pozwala na bardziej bezpośrednią ocenę pośredniego strumienia metabolicznego w krótkich odstępach czasu.

Kolejne próbki są poddawane analizie wolnych aminokwasów w całym organizmie nicienia przy użyciu metody HPLC, a także analizie wzbogacenia izotopowego aminokwasów i kwasów organicznych za pomocą GCMS, w celu ilościowego oznaczenia zmian w strumieniu metabolicznym u nicieni. Po ekspozycji na stabilne izotopy uzyskano wyniki wykazujące wpływ różnych czasów ekspozycji na izotopy, usuwania bakterii oraz alternatywnych metod rozbijania nicieni u osobników typu dzikiego, aby zbadać zawartość izotopową w metabolitach pośrednich. Metoda ta może dostarczyć wglądu w metabolizm pośredni.

Metodę tę można zastosować również w naszych systemach, takich jak linie komórkowe i tkanki ssaków. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zaobserwowaliśmy powtarzające się nieprawidłowości w analizie wolnych aminokwasów u nicieni przy użyciu HPLC, które sugerowały zaburzenie metabolicznego strumienia produktów pośrednich w pierwotnych zmianach funkcji oddechowych. Aby rozpocząć tę procedurę.

Robaki, które były eksponowane na metaboliczny prekursor znakowany izotopem stabilnym, albo podczas rozwoju, albo w wieku dorosłym, zbiera się do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Zazwyczaj rozcieńczamy robaki do stężenia 1000 robaków na jeden mililitr. Do robaków dodaje się 60% kwas perchlorowy zawierający kwas epsilon-aminokapronowy jako standard wewnętrzny, tak aby końcowe stężenie kwasu perchlorowego wynosiło 4%, a standardu wewnętrznego 20 nanomolar.

Pozostaw nicienie do osadzenia się pod wpływem grawitacji przez pięć minut, następnie usuń i zachowaj nadsącz w oddzielnej probówce. Następny krok jest jednym z najbardziej krytycznych etapów tej procedury. Przed analizą wolnych metabolitów nicienie muszą zostać całkowicie rozdrobnione poprzez homogenizację. Używając plastikowego homogenizatora i wiertarki elektrycznej, rozcieraj próbki nicieni przez 15 sekund.

Potwierdź wizualnie rozbicie nicieni za pomocą mikroskopii świetlnej i w razie potrzeby powtórz ucieranie. Na tym obrazie panele A i B przedstawiają nicienie przed ucieraniem. W przeciwieństwie do paneli C i D, które pokazują nicienie po ucieraniu, przenieś wcześniej zachowany supernatant do 1,5 mililitrowych plastikowych probówek do wirowania z homogenatem nicieni.

Wirować próbki przy 2250 RPM i 1300 Gs przez pięć minut. Po wirowaniu przenieść nadsącz do nowej szklanej probówki o pojemności siedmiu mililitrów. Osad zachować do późniejszego wykorzystania w teście stężenia białka.

Teraz dodaj cztery normalny wodorotlenek potasu do nadsączu, aż zakres pH próbek wyniesie od siedmiu do ośmiu, a następnie odwiruj. Zneutralizowane próbki w siedmiomililitrowych probówkach szklanych wiruj z prędkością 2 250 RPM (1300 Gs) przez pięć minut. Aby usunąć sole, przenieś nadsącz z każdej próbki do nowej siedmiomililitrowej probówki szklanej. Zneutralizowane próbki można teraz przygotować do oznaczania ilościowego metabolitów za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas (GCMS). W przypadku HPLC.

Oddziel 50 µL z każdej zneutralizowanej próbki do bezpośredniego wtrysku do HPLC. Ilościowe oznaczenie wolnych aminokwasów przeprowadza się przy użyciu prekolumnowej pochodniowienia aldehydem i detekcji fluorescencyjnej. Zgodnie z wcześniejszym opisem, pozostałe zneutralizowane próbki zostaną poddane ekstrakcji przy użyciu żywicy jonowymiennej do analizy GCMS w celu oznaczenia wzbogacenia izotopowego w aminokwasach i kwasach organicznych, jak pokazano w następnej sekcji.

Aby przygotować kuleczki, dodaj 1 N kwas solny oddzielnie do kuleczek G 1 oraz G 50. W zlewkach o pojemności 1 l mieszaj zawartość każdego naczynia przez 30 minut za pomocą mieszadła magnetycznego. Następnie przemyj kuleczki wodą dejonizowaną 10 razy, aż pH wody z przemywania zrówna się z pH wody.

Następnie zaprezentujemy naszą metodę przygotowywania niskokosztowych kolumn wykonanych na zamówienie z pipet szklanych. Gotowe kolumny są również dostępne w sprzedaży. Aby przygotować kolumnę, należy za pomocą pęsety włożyć czop bawełniany tuż nad najwęższą część końcówki pipety Pasteura, a następnie zastosować żel G 1 do ekstrakcji kwasów organicznych oraz żel G 50.

W celu ekstrakcji aminokwasów napełnić każdą kolumnę do około jednej trzeciej jej wysokości. Jeśli próbka ma już neutralne pH, przed nałożeniem jej na kolumnę AG one nie dodaje się do niej żadnych substancji. Aby przeprowadzić ekstrakcję kwasów organicznych w celu wyodrębnienia aminokwasów, do próbki przed nałożeniem jej na kolumnę AG 50 należy dodać 1 ml 0,1 N kwasu solnego.

Następnie nanieś wcześniej przygotowane zneutralizowane próbki na każdą kolumnę. Przemywaj każdą kolumnę 10 razy wodą, aż do uzyskania neutralnego pH popłuczyn. Po zakończeniu przemywania eluuj każdą kolumnę do świeżych, oznakowanych, czteromililitrowych szklanych fiolek na próbki. W celu ekstrakcji kwasów organicznych dodaj trzy mililitry trzech normalnego kwasu solnego do kolumny AG 1.

Umożliwia to analizę wzbogacenia izotopowego całkowitej liczby znakowanych węgli spośród gatunków trójwęglowych, czterowęglowych, pięciowęglowych i sześciowęglowych. W celu ekstrakcji aminokwasów należy dodać 3 mL 4 N wodorotlenku amonu do kolumny G 50. Pozwala to na analizę wzbogacenia izotopowego całkowitej liczby znakowanych węgli spośród gatunków trójwęglowych i pięciowęglowych.

Po zakończeniu ekstrakcji kwasów organicznych i aminokwasów, umieść fiolki z próbkami w ewaporatorze typu SpeedVac na całą noc, aż całkowicie wyschną. Następnie próbki należy zderywatyzować i przeanalizować za pomocą GCMS, zgodnie ze szczegółami opisanymi w tekście protokołu. Rozpocznij procedurę, przenosząc tysiąc młodych dorosłych nicieni na eksperymentalną płytkę NGM o średnicy 35 mm, zawierającą glukozę z uniwersalnie znakowanym węglem 13 oraz E. coli.

Następnie umieść eksperymentalną płytkę NGM bez przykrywki w specjalnej komorze szklanej wyposażonej w szczelny kurek trójdrożny, aby umożliwić precyzyjne pobieranie i wymianę atmosfery. Uszczelnienie w miejscu, w którym optycznie przezroczysta szklana tarcza opiera się o płytkę, pokryj smarem wysokopróżniowym.

Uszczelnij komorę za pomocą szklanego krążka. Zapisz czas. Przyjmując ten moment jako czas zero, po 30 minutach pobierz za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml próbkę 10 ml atmosfery z szklanej komory, korzystając z kurka trójdrożnego.

Zamknij kurek do komory. Po pobraniu próbki przenieś ją do czerwonej próżniowej rurki szklanej zawierającej 1 ml wodorowęglanu sodu w 0,1 M wodorotlenku sodu. Następnie wstrzyknij 10 ml powietrza do szklanej komory poprzez kurek trójdrożny. Używając strzykawki 20 ml, zamknij kurek do komory. Po ponownym wprowadzeniu atmosfery i przed wznowieniem inkubacji powtórz pobieranie próbek atmosfery z szklanej komory w 60, 90 i 120 minutach.

Przeanalizuj te próbki dwutlenku węgla atmosferycznego pod kątem wzbogacenia w znakowany węgiel, używając spektrometru mas stosunków gazów zgodnie z opisem w tekście protokołu; stabilne izotopy zostały dobrze włączone po dwóch godzinach do młodych dorosłych nicieni, co potwierdza pomiar znakowanego węgla w atmosferycznym dwutlenku węgla oraz w rozpuszczonym dwutlenku węgla w organizmach nicieni karmionych żywymi lub naświetlonymi promieniami UV zabitymi bakteriami E. coli szczepu OP 50. Stosunek dwutlenku węgla $^{13}\text{C}$ do dwutlenku węgla $^{12}\text{C}$ był większy w frakcji rozpuszczonego w nicieniach dwutlenku węgla w stosunku do uwolnionego dwutlenku węgla atmosferycznego. Zaobserwowano, że przedłużona ekspozycja na stabilny izotop od okresu larwalnego, a następnie utrzymywanie nicieni na podłożu NGM bez bakterii, zwiększyło wzbogacenie izotopowe wolnego glutaminianu u młodych dorosłych nicieni.

Na tym wykresie L1 reprezentuje nicienie karmione glukozą z uniwersalnie znakowanym węglem 13 oraz bakteriami OP50 od stadium larwalnego L1 do stadium młodego dorosłego 959 cell, natomiast YA reprezentuje nicienie karmione glukozą z węglem 13 i bakteriami OP50 przez 48 godzin, poczynając od momentu osiągnięcia pierwszego dnia składania jaj w stadium młodego dorosłego. Oś X wskazuje całkowitą liczbę znakowanych atomów węgla w każdym gatunku glutaminianu, a oś Y wskazuje procent wzbogacenia. Wszystkie zwierzęta zostały oczyszczone z nadmiaru znacznika izotopowego przed dalszym przygotowaniem próbek.

W analizach GCMS zielone słupki oznaczają nicienie oczyszczone po ekspozycji izotopowej poprzez karmienie szczepem OP 50 E. coli na płytkach NGM przez dwie godziny przed ekstrakcją PCA. Niebieskie i szare słupki oznaczają nicienie oczyszczone po ekspozycji izotopowej na płytkach NGM bez bakterii odpowiednio przez dwie lub sześć godzin przed ekstrakcją PCA, niezależnie od przebiegu czasu ekspozycji izotopowej. Nie zaobserwowano istotnych różnic w wzbogaceniu izotopowym metabolitów pośrednich w przypadku oczyszczania zwierząt na płytkach przez dwie lub sześć godzin.

W obu przebiegach ekspozycji izotopowej zaobserwowano mniejsze wzbogacenie izotopowe w metabolitach pośrednich, gdy zwierzęta były oczyszczane poprzez karmienie nieoznakowanymi bakteriami przez dwie godziny. W związku z tym ustalono, że optymalny protokół oczyszczania dla nicieni hodowanych na płytach NGM z wysiewem bakterii z izotopem polega na oczyszczaniu przez dwie godziny na płytach NGM bez wysiewu, aby zoptymalizować procent wzbogacenia w metabolitach pośrednich. Następnie przeprowadzono inkubację przez 24 godziny w kulturze płynnej z glukozą znakowaną węglem 13 w pozycji sześć, bez dodatku bakterii.

Na tej rycinie przedstawiono porównanie próbek nicieni poddanych samej sonikacji oraz sonikacji połączonej z rozcieraniem. Nicienie poddane sonikacji i rozcieraniu wykazały większe wzbogacenie izotopowe niż próbki poddane wyłącznie sonikacji. Ostatecznie żywe nicienie karmiono stabilnym prekursorem izotopowym albo podczas rozwoju od stadium L1 na płytkach, albo począwszy od pierwszego dnia składania jaj jako młode dorosłe osobniki przez 24 godziny w kulturze płynnej. Pozwoliło to na czułą analizę wzbogacenia izotopowego metabolitów wskazujących na przepływ przez glikolizę oraz metabolizm pirogronianu w cyklu kwasów trójkarboksylowych po jego rozwoju.

Technika ta utorowała drogę badaniom nad chorobami mitochondrialnymi w celu analizy pośredniego strumienia metabolicznego u C. elegans. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat przeprowadzania stabilnego profilowania izotopowego metabolizmu pośredniego oraz strumienia metabolicznego u nicieni C. elegans.