Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

W tym filmie pokażemy Państwu, jak synchronizować *C. elegans* na etapie pierwszego stadium larwalnego (L1). Jest to metoda prosta, lecz bardzo powszechna, zatem okaże się ona niezwykle użyteczna dla osób rozpoczynających pracę z tym organizmem.

Jeśli jesteś ekspertem w tej dziedzinie, możesz znaleźć tutaj kilka wskazówek dotyczących optymalizacji tego protokołu. Podstawą synchronizacji nicieni jest względna odporność embrionów w porównaniu do dorosłych osobników na zasadowy roztwór podchlorynu. Dorosłe nicienie, zawierające wewnątrz liczne embriony, są inkubowane w roztworze podchlorynu w taki sposób, aby zostały zabite, pozostawiając jedynie żywe embriony.

Druga część synchronizacji jest osiągana poprzez brak pożywienia, dzięki czemu mimo że embriony wykluwają się w różnym czasie, nie rozwijają się poza stadium L1. Pierwszym krokiem w celu rozpoczęcia protokołu błyskawicznego jest doprowadzenie nicieni do etapu składania jaj, tak aby na płytce znalazło się kilka rozproszonych jaj. Do odzyskania dorosłych osobników w celu zbioru należy użyć M9.

Dodatkowo zarodki znajdujące się już na powierzchni płytki można zebrać, zeskrobując je miękkim materiałem, np. fragmentem kliszy rentgenowskiej, a następnie wypłukać zebrane bakterie kilkukrotnym przemyciem w M9. Zazwyczaj wystarczają dwa takie przemycia. Po wypłukaniu nicieni należy dodać świeżo przygotowany roztwór wybielający, zgodnie z preferencjami.

Kontroluj czas inkubacji, potrząsając probówką. Możesz monitorować powstawanie dorosłych osobników pod mikroskopem stereoskopowym. Gdy nie będzie już niemal żadnych martwych ciał, przerwij reakcję, dodając M nine, aż probówka zostanie całkowicie wypełniona.

Aby zakończyć protokół, wykonaj co najmniej trzy przemycia. Jaja inkubuje się przez noc w buforze M9 przy ciągłym wytrząsaniu, co umożliwia wyklucie, ale zapobiega dalszemu rozwojowi nicieni. Choć synchronizację można przeprowadzać w dowolnej temperaturze od 15 do 25 stopni, zaleca się temperaturę 15°C.

Ponieważ rozwój przebiega wolniej, jak wspomniano w trakcie omawiania jego przebiegu, C. elegans przechodzi przez cztery stadia larwalne przed osiągnięciem wieku dojrzałego, a czas ten zależy od temperatury hodowli. Chociaż C. elegans toleruje temperatury wzrostu w zakresie od 15 do 25 stopni, tempo wzrostu jest wyższe w górnej granicy tego zakresu.

W wyższej temperaturze można zauważyć, że po 24 godzinach stadia rozwoju nicieni są różne. W temperaturze 15 i 25 stopni, po 48 godzinach w 25 stopniach, obserwujemy już embriony. Jednakże, aby dostrzec embriony na powierzchni płytek, musimy odczekać ponad 80 godzin.

Aby uzyskać optymalne wyniki przy hodowli nicieni w temperaturze 15 °C, podczas przeprowadzania eksperymentu typu „blitzing” należy wziąć pod uwagę kilka kwestii. Ważne jest również rozpoznanie nicieni znajdujących się w stadium pożądanym dla danego eksperymentu. Pokażemy zatem, jak rozróżniać stadia rozwojowe, wykorzystując wielkość organizmów, mikroskopię interferencyjną z kontrastem fazowym lub barwienie.

Na tym wykresie można zauważyć tempo wzrostu dżdżownic GaN w zależności od temperatury; jak wspomniano, rosną one znacznie szybciej w temperaturze 25 stopni. Istnieje korelacja między rozmiarem zwierzęcia a jego rozwojem w środowisku morskim. Przy użyciu odpowiedniego oprogramowania można zmierzyć zwierzęta, a następnie zaklasyfikować je do właściwego stadium rozwojowego.

Zgodnie z tym wykresem pozycja jest jednak ogólnym wskaźnikiem etapów rozwojowych. Bardziej spójne określanie etapów można osiągnąć poprzez obserwację części zapasów, anatomii, którą można zidentyfikować i wykorzystać za pomocą mikroskopii kontrastowej różnicowej lub barwienia DPI. W naszym laboratorium stosowaliśmy ten protokół do synchronizacji nicieni w różnych eksperymentach, takich jak barwienie pojedyncze mikrojaj, wizualizacja in situ oraz barwienie up.

Ponadto protokół ten pomaga wyeliminować zanieczyszczenia. W celu zwiększenia kontrastu stosuje się mikroskopię z różnicowym kontrastem interferencyjnym lub mikroskopię Nomarski. W niebarwionych, przezroczystych próbkach zwierzęta są montowane na żywo na podłożu z 2% Agros; agros można przygotować wcześniej i przechowywać w temperaturze czterech stopni do momentu użycia.

Można go stopić i przechowywać w temperaturze 65 stopni. Po stopieniu agarozy, naklej taśmę na szkiełko przedmiotowe i umieść je po obu stronach trzeciego szkiełka. Ostrożnie pobierz niewielką ilość agarozy i nanieś kroplę na szkiełko bez taśmy.

Przykryj agary innym szkiełkiem przedmiotowym umieszczonym poprzecznie. Gdy ścieżka stężeje, rozdziel oba szkiełka, ostrożnie przesuwając jedno względem drugiego. Plasterek przyklei się do jednego z nich.

Nanieś niewielką ilość agaru na podkładkę, aby unieruchomić nicienie. Wybierz kilka osobników pod mikroskopem stereoskopowym i przenieś je do kropli M2. Unikaj uszkadzania ciała zwierzęcia.

Należy wziąć szkiełko nakrywkowe i nanieść niewielką ilość laku do paznokci na jego krawędzie. Ostrożnie umieść nakrywkę na szkiełku przedmiotowym, zapobiegając powstaniu pęcherzyków powietrza. Preparat można obserwować natychmiast pod mikroskopem. Jedną z najłatwiejszych do zidentyfikowania cech anatomii C. elegans jest gardło.

Na przykład, aava o kształcie choinki jest charakterystyczna dla stadium L4. Szczegółowe informacje o anatomii c elgan w trakcie rozwoju można znaleźć na stronie www.orla.org. Barwienie Tapis jest powszechną procedurą służącą do identyfikacji poszczególnych komórek.

Fiksacja metodą tunelu jest szybkim sposobem utrwalania nicieni. W celu barwienia DAPI, najpierw nanieś kroplę buforu M9 na powierzchnię szkiełka przedmiotowego. Pobierz kilka nicieni bezpośrednio z płytki i przenieś je do kropli buforu M9.

Usuń nadmiar M nine za pomocą pipety lub chusteczki. Utwórz tunel dla nicieni. Powtórz tę czynność.

Po wyschnięciu pierwszej kropli należy dodać odrobinę medium montażowego z API oraz oversleep przed przeniesieniem preparatu pod mikroskop. Rozwój go można łatwo obserwować w ciepłym stencie z api.