Potencjały błonowe, odpowiedzi synaptyczne, obwody neuronalne, neuromodulacja i histologia mięśni z wykorzystaniem raka rzecznego: ćwiczenia laboratoryjne dla studentów

Ogólnym celem następujących doświadczeń jest zrozumienie właściwości błon pobudliwych oraz jonowych podstaw spoczynkowego potencjału błonowego, a także poznanie metod pomiaru potencjału błonowego oraz zademonstrowanie właściwości przewodzenia synaptycznego. W jednej części doświadczenia mierzony będzie spoczynkowy potencjał błonowy przy jednoczesnej zmianie stężenia potasu pozakomórkowego. W drugiej części doświadczenia zbadane zostaną mechanizmy różnicowania synaptycznego poprzez rejestrację stymulowanych odpowiedzi synaptycznych w różnych jednostkach motorycznych.

Następnie przedstawiono obwód neuronalny, który jest łatwy w utrzymaniu. Preparat ten może być wykorzystywany zarówno do celów dydaktycznych, jak i do badania różnych aspektów obwodu rozciągającego się od receptora sensorycznego, przez OUN i neuron motoryczny, aż po mięsień. Ten zestaw eksperymentów pokazuje łatwość wykorzystania modelu raka do analizy zagadnień związanych z potencjałem błonowym, integracją i transmisją synaptyczną oraz różnicami strukturalnymi typów włókien mięśniowych.

Głównymi zaletami wykorzystania preparatu z raków w nauczaniu koncepcji i technik elektrofizjologicznych są łatwość przeprowadzenia sekcji, żywotność preparatu w minimalnej ilości soli fizjologicznej, łatwość uzyskania odpowiedzi synaptycznych oraz łatwość rozpoznania ogólnego układu anatomicznego mięśni. Techniki te można zastosować również do innych preparatów, co pozwoli pogłębić naszą wiedzę na temat fizjologii i modulacji synaptycznej oraz różnic biochemicznych i strukturalnych w zaprezentowanym preparacie. Aby rozpocząć zabieg, należy wybrać raka o długości ciała około 6–10 cm i umieścić go w kruszonym lodzie na pięć minut w celu znieczulenia; aby odciąć głowę raka, należy chwycić go za tył głowy, uważając, aby palce nie znajdowały się w zasięgu szczypiec i aparatu gębowego zwierzęcia, używając dużych nożyczek.

Szybko odetnij głowę, wykonując czyste cięcie za oczami homara, a następnie usuń odnóża i szczypce, aby uniknąć obrażeń. Usuń style u samców oraz pływaki u obu płci. Pozbyć się głowy i wyrostków.

Następnie oddziel odwłok od klatki piersiowej, wykonując cięcie wzdłuż błony stawowej łączącej odwłok i klatkę piersiową. Zachowaj część odwłokową raka, a klatkę piersiową usuń. Kierując nożyczki lekko w dół w stronę strony brzusznej i pod kątem, wykonaj nacięcie w pancerzu wzdłuż dolnej krawędzi bocznej po każdej stronie odwłoka. Należy uważać, aby nie przeciąć ciała raka zbyt głęboko.

Używając pęsety, podążaj za naturalnym układem linii pancerza raka, które biegną wzdłuż każdego segmentu. Usuń brzuszną część pancerza, odciągając ją do góry i do tyłu, uważając, aby nie uszkodzić mięśni brzusznych.

Usuń mięśnie zginacze. Na tym etapie na wierzchu głębokich mięśni zginaczy widoczna jest biała masa tkankowa. Ostrożnie usuń tę tkankę za pomocą pęsety.

Przewód pokarmowy jest teraz widoczny jako cienka rurka przebiegająca wzdłuż linii środkowej mięśni głębokich zginaczy. Usuń go, chwytając pęsetą w górnej części i odsuwając od brzucha. Przetnij dolny odcinek przewodu pokarmowego na końcu ogona.

Przepłucz preparat solą fizjologiczną, aby upewnić się, że pozostałości treści żołądkowo-jelitowej nie zakłócą przygotowania. Używając szpilek sekcyjnych, przymocuj górne i dolne rogi preparatu do szalki Petriego powlekanej S guard. Mięśnie prostowniki brzucha są teraz odsłonięte.

Wlej roztwór soli fizjologicznej do szalki Petriego, aby pokryć preparat aż do momentu wykonania rejestracji wewnątrzkomórkowych. Przenieś szalkę Petriego pod mikroskop i użyj wosku pod szalką, aby zapobiec jej przesuwaniu się. Aparatura wykorzystywana do rejestracji wewnątrzkomórkowych przedstawiona jest na tej rycini.

Odpowiednie połączenia i ustawienia podano w towarzyszącym tekście. Skonfiguruj oprogramowanie do wykresów laboratoryjnych zgodnie z instrukcjami. Zgodnie z treścią tekstu towarzyszącego, umieść przewód uziemiający w kąpieli solnej.

Wprowadź końcówkę szklanej mikropipety wypełnionej trzy molarnym chlorkiem potasu do kąpieli solnej i sprawdź oporność elektrody. Oporność elektrody powinna wynosić od 20 do 60 mega omów. Użyj pokrętła grubej regulacji w wzmacniaczu, aby przy silnym oświetleniu przesunąć linię na wykresie laboratoryjnym do zera.

Patrząc przez mikroskop, zidentyfikuj podłużne mięśnie DEM. Za pomocą sondy elektrodowej wprowadź elektrodę wewnątrzkomórkową do włókna mięśniowego mięśnia DEM. Elektrodę należy wprowadzić zaledwie do wnętrza włókna mięśniowego.

Należy uważać, aby nie przebić komórki na wylot. Zmierz amplitudę potencjału spoczynkowego. Przeciągnij kursor M na zapis z miejsca znajdującego się w lewym dolnym rogu okna wykresu.

Umieść znacznik M na linii bazowej i przesuń kursor do najniższego punktu zarejestrowanego sygnału. Różnica między znacznikiem a aktywnym kursorem jest wyświetlana w górnej prawej części ekranu. Wartość ta stanowi napięcie spoczynkowego potencjału błonowego.

Podziel zarejestrowane napięcie przez wartość wzmocnienia; w tym przypadku zastosowano wzmocnienie 10x. Następnie przelicz napięcie z woltów na miliwolty. Po zarejestrowaniu potencjału spoczynkowego tej włókna mięśniowego, obserwując preparat pod mikroskopem, ostrożnie usuń elektrodę z włókna mięśniowego.

Powtórz rejestrację wewnątrzkomórkową na innych włóknach mięśniowych. Kolejna część tego eksperymentu będzie polegała na monitorowaniu wpływu zwiększenia stężenia potasu pozakomórkowego na potencjał spoczynkowy błony. Zastosowane zostaną sześć roztworów soli fizjologicznej dla homarów o stężeniach potasu wynoszących 5.4, 20, 40, 60, 80 i 100 millimolar.

Do kolejnego pomiaru wewnątrzkomórkowego, pomiędzy sesjami nagraniowymi, wybierz mięsień, który nie wykazuje drgań. Wymień roztwór w kąpieli na roztwór chlorku potasu o następnym, wyższym stężeniu. Upewnij się, że preparat jest za każdym razem całkowicie przykryty.

Zarejestruj zmiany potencjału błonowego dla każdego roztworu. Efekt zwiększenia zewnątrzkomórkowego stężenia potasu, czyli potencjał błonowy, przedstawiono na tym zrzucie ekranu; nanieś potencjały spoczynkowe dla każdego stężenia potasu na wykres półlogarytmiczny zależności potencjału błonowego od zewnątrzkomórkowego stężenia potasu. Wyrównaj potencjał spoczynkowy przy zewnątrzkomórkowym stężeniu potasu 5,4 mM.

W przypadku krzywych hipotetycznych i obserwowanych należy porównać nachylenie linii obserwowanej z nachyleniem linii hipotetycznej. Po zakończeniu rejestracji elektrofizjologicznej kolejnym krokiem jest zbadanie anatomii włókien mięśniowych oraz wzorca ich unerwienia. Przenieś preparat do naczynia stojącego i dodaj błękit metylenowy.

Po pięciu minutach usunąć błękit metylenowy i dodać świeżą sól fizjologiczną dla raków. Zlokalizować główny nerw unerbiający mięśnie w obrębie jednego segmentu. Naszkicować schemat unerwienia mięśni S-E-M-D-E-L 2D EL one oraz DEM w segmencie.

Następnie przenieś preparat pod dygestorium. Usuń sól fizjologiczną i dodaj utrwalacz. Jako utrwalacz zastosowano tutaj roztwór Bouina.

Celem użycia dygestorium jest uniknięcie kontaktu z oparami utrwalacza. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dopuścić do kontaktu tego roztworu ze skórą lub oczami. W przypadku pieczenia oczu należy je niezwłocznie przemyć w stacji do płukania oczu.

Pozostaw roztwór boin na preparacie przez około 10 minut, a następnie za pomocą pipety wymień roztwór na sól fizjologiczną. Wytnij cienki fragment mięśnia DEL one lub DEL two. Umieść go na szkiełku przedmiotowym.

Oznakuj preparat. Powtórz procedurę dla mięśnia SEM. Użyj mikroskopu złożonego, aby obejrzeć wzór prążkowania sarkomerów w obu preparatach tkanek.

Kolejna seria eksperymentów pozwoli zbadać sposób rejestrowania odpowiedzi synaptycznych w mięśniach brzusznych raka. Wybierz innego raka i dokonaj jego dekapitacji. Usuń klatkę piersiową oraz odnóża i odsłoń mięśnie prostowniki brzucha, zgodnie z procedurą chirurgiczną przedstawioną na filmie.

W pierwszej części tego filmu, przy użyciu mikroskopu, zlokalizuj nerw prowadzący aksony ruchowe do mięśni prostowników. Wybierz segment z najbardziej dostępnym nerwem. Nerw ma biały kolor i można go uwidocznić, rozpylając solę fizjologiczną na preparat za pomocą pipety lub delikatnie dmuchając na preparat.

Powoduje to poruszenie się nerwu, co ułatwia jego identyfikację. Umieść elektrodę ssącą zamocowaną w mikromanipulatorze bezpośrednio nad nerwem. Delikatnie pociągnij tłok strzykawki, aby wciągnąć nerw do wnętrza elektrody.

Przez mikroskop można zobaczyć nerw wciągany do elektrody. Dostosuj ustawienia w oprogramowaniu do wykresów laboratoryjnych zgodnie z instrukcjami w towarzyszącym artykule. Napełnij szklaną mikroelektrodę 3 M chlorkiem potasu, a następnie podłącz ją do głowicy wzmacniacza i systemu PowerLab.

Użyj pokrętła ustawienia wstępnego (course) w wzmacniaczu, aby przesunąć linię na wykresie laboratoryjnym do zera. Przed włożeniem elektrody przełącznik powinien zostać kilkukrotnie włączony i wyłączony. Aby sprawdzić rezystancję elektrody, zmierz amplitudę uzyskanych wartości.

Patrząc przez mikroskop, użyj sondy elektrodowej, aby wprowadzić elektrodę do jednego z podłużnych włókien mięśniowych: DEM, DL one lub DL two. Należy uważać, aby nie przebić włókna mięśniowego na wylot. Preparat jest teraz gotowy do eksperymentu.

Elektroda ssąca służy do stymulacji segmentowej wiązki nerwowej, a szklana mikroelektroda do rejestracji odpowiedzi synaptycznej z włókna mięśniowego; należy uruchomić stymulator w celu stymulacji nerwu z częstotliwością 1 Hz dla odpowiedzi fazowych. Następnie należy umieścić elektrodę w włóknie mięśnia SEL. SEL jest mięśniem tonicznym.

Stymuluj nerw krótkimi seriami impulsów z częstotliwością 10 hertz w celu wywołania odpowiedzi tonicznych. Porównaj zarejestrowane odpowiedzi mięśni DEL i SEL. Zauważ, że fazowe mięśnie DEL wykazują synaptyczne odpowiedzi o większej amplitudzie niż toniczne mięśnie SEL.

Kolejna seria eksperymentów koncentruje się na mięśniach zginaczach raków, a nie na mięśniach prostownikach. Rozpoczynając od nowego raka, wyizoluj odwłok zgodnie z instrukcją przedstawioną w tym zabiegu chirurgicznym. W pierwszej części tego filmu umieść wyizolowany preparat ogona w naczyniu Petri wypełnionym solą fizjologiczną, a następnie przypnij ogon oraz górną część preparatu.

Należy pamiętać, że w eksperymentach na tonicznych mięśniach zginaczach rdzeń nerwowy brzuszny musi pozostać nienaruszony. Używając skalpela, należy wykonać cięcie wzdłużne przez błonę stawową pomiędzy dwiema żebrami po stronie brzusznej preparatu. Podczas wykonywania tego cięcia należy zachować szczególną ostrożność, aby nie przeciąć tkanek zbyt głęboko, ponieważ głębokie cięcie mogłoby przeciąć korzeń nerwu ruchowego; należy upewnić się, że mięśnie powierzchowne nie zostały uszkodzone.

Wykonaj następny krok. Patrząc przez mikroskop, za pomocą nożyczek lub skalpela wykonaj poziome cięcie od cięcia podłużnego w cienkiej warstwie błony pokrywającej mięsień. Powiększ nacięcie, aby stworzyć płatek błony stawowej, a następnie unieś płatek do góry.

Używając nożyczek, odetnij płat skóry, aby odsłonić powierzchowne mięśnie zginacze w celu przeprowadzenia rejestracji wewnątrzkomórkowej z tych mięśni. Wykorzystaj tę samą aparaturę i ustawienie, które zostały zastosowane do rejestracji potencjału spoczynkowego błony oraz odpowiedzi synaptycznych z prostowników brzusznych. Podobnie jak poprzednio, użyj elektrody wewnątrzkomórkowej wypełnionej 3 M chlorkiem potasu.

Wprowadź elektrodę do włókna mięśniowego powierzchownych mięśni zginaczy, uważając, aby nie przebić mięśnia na wylot. Zarejestruj aktywność spontaniczną EPSP. Zwróć uwagę na różne amplitudy EPSP oraz sprawdź, czy występują jakiekolwiek IPSP.

Używając małego pędzla, ostrożnie przesuń nim wzdłuż brzegu kutykuli w obrębie tego samego segmentu, w którym znajduje się elektroda rejestrująca. Odnotuj jakąkolwiek zmianę częstotliwości lub amplitudy EPSP wywołaną stymulacją, jeśli zaobserwowana zostanie silniejsza odpowiedź. Wskazywałoby to na rekrutację dodatkowych neuronów ruchowych reagujących na zmianę aktywności nerwu czuciowego.

Starannie wymień roztwór w kąpieli soli fizjologicznej na roztwór zawierający neuromodulator, taki jak 1 µM serotoniny, lub sól fizjologiczną nasyconą dwutlenkiem węgla. Następnie powtórz stymulację pędzlem. Zwróć uwagę na wpływ zmiany roztworu kąpieli na zarejestrowaną aktywność.

Zmień roztwór soli w kąpieli z powrotem na sól fizjologiczną i zaobserwuj, że aktywność włókna mięśniowego powróci do poziomu bazowego. Ta rycina przedstawia zapisane EPSP w powierzchownym włóknie mięśnia zginacza. Zwróć uwagę na różne wielkości EPSP.

Kolejny etap tego eksperymentu wykorzystuje elektrodę zewnątrzkomórkową do monitorowania potencjałów czynnościowych neuronów ruchowych reagujących na aktywność w obwodzie czuciowym prowadzącym do OUN i dalej do neuronów ruchowych. Rozpocznij od wykonania elektrody ssącej do stymulacji nerwów czuciowych. Rozciągnij fragment plastikowej rurki nad płomieniem.

Kolejnym krokiem jest przycięcie rurki do pożądanego rozmiaru. Aby to zrobić, należy przyjrzeć się nerwowi w preparacie, by ocenić pożądaną średnicę otworu elektrody ssącej. W zależności od wielkości raka, pęczki nerwowe mogą mieć średnicę od około jednego milimetra do kilku milimetrów.

Odetnij rozciągnięty odcinek rurki, aby otwór w końcówce miał odpowiednią wielkość, umożliwiającą stabilne utrzymanie nerwu. Jeśli otwór będzie zbyt duży, nerw może z niego wypadnąć. Jeśli otwór będzie zbyt mały, nerw może zostać uszkodzony przez nacisk elektrody.

Umieść plastikową rurkę na końcówce szklanej elektrody ssącej. Konfiguracja elektrofizjologiczna i programowa nieco różni się w przypadku monitorowania odpowiedzi zewnątrzkomórkowych w porównaniu do konfiguracji rejestracji wewnątrzkomórkowych. Korzystając ze sprzętu określonego w towarzyszącym artykule, wciągnij trzecią drogę unerwiającą powierzchowny mięsień zginacz do elektrody ssącej.

Można teraz rozpocząć rejestrację potencjałów czynnościowych. Ta ścieżka obejmuje pięć pobudzających neuronów ruchowych i jeden hamujący neuron ruchowy. Po zarejestrowaniu aktywności bazowej, należy stymulować kutykulę pędzlem, aby zaobserwować zmianę w generowanych potencjałach czynnościowych.

Następnie zastąp roztwór kąpielowy neuromodulatorami, takimi jak serotonina, analogicznie do poprzedniego eksperymentu, i zarejestruj wszelkie zmiany w odpowiedzi. Dodatkowe ćwiczenia znajdują się w towarzyszącym tekście. To nagranie przedstawia potencjały czynnościowe zarejestrowane z trzeciej drogi przed i w trakcie stymulacji kutykuli pędzelkiem; porównaj częstotliwość potencjałów czynnościowych przed szczotkowaniem z ich częstotliwością podczas stymulacji.

To nagranie przedstawia potencjały czynnościowe zarejestrowane z trzeciej drogi w roztworze soli fizjologicznej oraz w roztworze serotoniny. Porównaj częstotliwość potencjałów czynnościowych w soli fizjologicznej z ich częstotliwością po dodaniu serotoniny. Stymulacja mechaniczna (pocieszenie) zwiększa częstotliwość wyładowań względem poziomu bazowego.

Wykazano również, że serotonina zwiększa częstotliwość wyładowań w porównaniu z solą fizjologiczną. Rysunek ten pokazuje, że przy jednoczesnym zastosowaniu szczotkowania i serotoniny następuje jeszcze większy wzrost częstotliwości wyładowań. Porównanie efektów wpływu zewnętrznego stężenia potasu na potencjał spoczynkowy błony, uzyskanych eksperymentalnie i teoretycznie, wskazuje na wpływ jonów na potencjał błonowy.

Przedstawiliśmy również sposób rejestracji odpowiedzi na ntic w złączaach nerwowo-mięśniowych zarówno w mięśniach fazowych, jak i tonicznych. Techniki te mogą być wykorzystywane w badawczych laboratoriach studenckich do nauczania podstawowych koncepcji i fizjologii. Metody opracowane w ramach tego ćwiczenia laboratoryjnego mogą posłużyć do udzielenia odpowiedzi na pytania związane z innymi preparatami laboratoryjnymi, a także do zastosowań fizjologicznych w medycynie i ochronie zdrowia.