Eksperymenty fizjologiczne z jelitem tylnym raków: ćwiczenie laboratoryjne dla studentów

Ogólnym celem niniejszego opracowania jest posłużenie jako narzędzie dydaktyczne dla uczniów szkół średnich na poziomie zaawansowanym oraz studentów studiów licencjackich na kursach fizjologii uczestniczących w eksperymentach fizjologicznych. Studenci uczą się odsłaniać i rejestrować skurcze jelita tylnego raka rzecznego. Kolejnym krokiem jest wycięcie jelita tylnego z organizmu zwierzęcia, co umożliwia bezpośrednią aplikację związków.

Następnie monitoruje się siłę i rytm skurczów mięśni gładkich jelita tylnego podczas stosowania różnych czynników farmakologicznych, aby zbadać mechanizmy zmieniające siłę skurczu. Na podstawie testów farmakologicznych i subtypów receptorów uzyskuje się wyniki wykazujące działanie modulatorów na unerwienie lub bezpośrednio na mięśnie. Witam, jestem dr J. Mercier z Katedry Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Brocka.

Wykorzystuję jelito tylne raka jako preparat do prowadzenia badań nad neurotransmiterami sterującymi mięśniami trzewnymi. Używam go również jako narzędzia dydaktycznego i w ramach współpracy z laboratorium dr. Robina Coopera z University of Kentucky dopracowujemy szereg eksperymentów prowadzonych przez studentów w celach nauczania. Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat funkcji jelita tylnego raka.

Metoda ta może być również stosowana w badaniach nad schorzeniami, takimi jak choroby obejmujące rytmy perystaltyczne. Może być także wykorzystywana do opisu mechanizmów leżących u podstaw modulacji unerwienia mięśniowego i neuronalnego. Studenci nauczą się interpretować dane fizjologiczne i farmakologiczne przy użyciu środków farmakologicznych, neuroprzekaźników oraz neurohormonów, a także zdobędą ogólną wiedzę na temat funkcji receptorów.

W odniesieniu do agonistów i antagonistów studenci sporządzą krzywe dawka-odpowiedź oraz przedstawią dane w formie graficznej do analizy statystycznej. Aby znieczulić zwierzę, należy umieścić rak o długości ciała od 6 do 10 cm na lodzie na 5 do 10 minut. Znieczulonego raka należy utrzymać jedną ręką za szczypcami. Szybko naciąć od oczodołu do środka głowy po obu stronach, a następnie odciąć głowę raka.

Krew z preparatu po wyschnięciu stanie się lepka, dlatego należy umyć narzędzia po zakończeniu pracy. Następnie odetnij płetwy brzuszne i promienie płetwowe. Potem odetnij lewą i prawą płetwę ogonową, pozostawiając środkową płetwę ogonową, przecinając wzdłuż strony grzbietowej brzucha aż do ostatniego segmentu.

Następnie przetnij wzdłuż ostatniego segmentu i w dół po drugiej stronie. Usuń pancerz grzbietowy. Umieść rozsektowanego raka w wyłożonej watą płytce Petriego.

Uboga solanka dla raka. Aby zabezpieczyć preparat, należy użyć pinezek sekcyjnych, aby przymocować go do szalki Petriego. Jelito końcowe jest zazwyczaj otoczone masą naczyń krwionośnych i tkanki łącznej.

Usuń je pęsetą, uważając, aby nie uszkodzić jelita. Odcinek tylny jelita jest teraz widoczny wzdłuż odwłoka.

Pozostaw preparat z przekrojonego raka w roztworze soli fizjologicznej przez około 10 minut, aby mógł on dojść do siebie po szoku wywołanym sekcją i ekspozycją na sól fizjologiczną. Obserwuj powolne skurcze perystaltyczne jelita tylnego. W tym momencie można obliczyć częstotliwość skurczów.

Policz liczbę skurczów występujących w ciągu 30 sekund i zapisz wynik w dzienniku. Odnotuj również rodzaj występujących skurczów oraz to, czy mają one charakter perystaltyczny, czy spastyczny. Zapisz kierunek wszelkich fal perystaltycznych.

Policz częstotliwość skurczów w pobliżu odbytu oraz w połowie długości brzucha i sprawdź, czy istnieją różnice w częstotliwości między tymi dwoma obszarami. Przygotuj zestaw roztworów testowych o temperaturze takiej samej jak temperatura soli fizjologicznej do kąpieli. Pierwszym testowanym tutaj roztworem będzie 1 µM serotoniny przygotowany w soli fizjologicznej dla raków.

Za pomocą pipety usuń sól fizjologiczną z jam ciała odsłoniętego odwłoka rakowa i nanieś roztwór serotoniny o stężeniu 1 µM bezpośrednio na jelito tylne. Bezpośrednio po dodaniu nowego roztworu odczekaj 30 s, a następnie policz skurcze w okolicy odbytu przez kolejne 30 s, a potem policz skurcze w połowie długości odwłoka przez następne 30 s. Zapisz te wartości w tabeli oraz odnotuj rodzaj występujących skurczów.Dalej.

Wylać roztwór testowy z naczynia pomiarowego i kilkakrotnie wypłukać jelito tylne standardową solą fizjologiczną dla raków. Następnie płukać preparat co 30 sekund przez pięć minut. W tym momencie można dodać kolejny roztwór testowy, którym w tej demonstracji jest 1 µM dopaminy.

Zapisz obserwacje w taki sam sposób jak wcześniej i powtórz ten proces dla pozostałych badanych związków. W przypadku stosowania wielu stężeń tej samej substancji należy pamiętać, aby zacząć od najniższego stężenia i przechodzić do stężeń wyższych. Układ do pomiaru siły skurczów przewodu pokarmowego obejmuje laptop z oprogramowaniem LabChart 7, Bridge Pod, PowerLab 26T oraz przetwornik siły.

Przed pomiarem siły skurczów mięśni przewodu pokarmowego należy wyizolować układ pokarmowy. Aby to osiągnąć, odetnij mięśnie w ostatnim segmencie odwłoka, umieść dwa lub więcej szpilek przez miękką kutykulę brzuszną po obu stronach odbytu, a następnie odetnij resztę odwłoka, pozostawiając jelito tylne i odbyt przymocowane do niewielkiego fragmentu kutykuli. Jelito należy odciąć blisko miejsca połączenia klatki piersiowej z odwłokiem.

Teraz przenieś przewód pokarmowy do płytkiej szalki z dnem pokrytym agarozą. Wzdłuż grzbietowej części przewodu pokarmowego biegnie naczynie krwionośne. Ostrożnie oddziel je od przewodu pokarmowego.

Wlej świeżą solankę dla raka na preparat. Przesuń przetwornik siły nad preparat. Przyjrzyj się uważnie bolcowi przyklejonemu do spodu przetwornika siły.

Koniec, który mocuje się do jelita, posiada niewielkie zagięcie. Przymocuj zagięty koniec szpilki do przeciętego końca jelita tylnego. Po przymocowaniu jelita tylnego delikatnie przesuń naczynie, aż jelito tylne zostanie napięte.

Należy zachować ostrożność podczas tego etapu, ponieważ jelito powinno być napięte, ale nie zbyt mocno. Zbyt silne napięcie może uszkodzić mięsień. Gdy naczynie znajduje się w optymalnej pozycji, należy użyć wosku lub gliny, aby je ustabilizować.

Następnie uruchom oprogramowanie. Aby rozpocząć rejestrację, otwórz oprogramowanie LabChart. Zamknij okno powitalne (Welcome Center) programu LabChart.

Przejdź do ustawień (setup) w lewym górnym rogu. Kliknij ustawienia kanałów (channel settings) w lewym dolnym rogu. Zmień ustawienia kanałów tak, aby pozostał tylko jeden kanał.

Kliknij OK po prawej stronie ekranu. Przejdź do kanału jeden (channel one) i otwórz panel bridge pod. Ustaw zakres na najwyższą czułość, w tym przypadku 200 µV, znajdującą się w górnym prawym rogu wykresu.

Ustaw liczbę cykli na sekundę na 2K. Można teraz rozpocząć rejestrację. Kliknij start, aby upewnić się, że układ działa prawidłowo.

Lekko dotknij końcówki przetwornika pipetą. Powinnaś zaobserwować zmianę siły rejestrowanej przez oprogramowanie. Kliknij stop w oprogramowaniu, następnie kliknij start i pozwól programowi działać.

Po około 20 sekundach kliknij stop i dodaj komentarz z etykietą saline. Oblicz częstość skurczów, mierząc czas od początku jednego wychylenia do początku następnego lub licząc całkowitą liczbę wychyleń w ciągu jednej lub dwóch minut. Oblicz częstość jako liczbę skurczów na minutę lub skurczów na sekundę, w zależności od tego, jak szybko występują.

Aby zmierzyć siłę skurczów, należy zastosować pomiar względny w celu porównania skurczów w różnych warunkach na zapisanym pliku. Przesuń znacznik M do linii bazowej, a następnie przesuń kursor do szczytu wychylenia i zanotuj wartość wyświetlaną w prawym górnym rogu ekranu. Jest to wartość delta, stanowiąca różnicę między punktem M a szczytem.

Należy pamiętać, że kursor musi pozostać w bezruchu na szczycie, aby zmierzyć zmianę. Następnie należy przenieść marker M oraz kursor do kolejnej interesującej formy fali i powtórzyć pomiar, aby zbadać wpływ modulatorów. W tym preparacie należy powoli zamienić sól fizjologiczną na roztwór testowy.

W tym przypadku należy zastosować jedną mikromolarną dawkę serotoniny i kontynuować pomiar częstotliwości oraz siły skurczów jako ostatni test. W tej preparacji należy sprawdzić, czy inhibitory złączy szczelinowych zmieniają częstotliwość lub siłę skurczów; inhibitory złączy szczelinowych obejmują m.in. heptanol lub sól fizjologiczną nasyconą dwutlenkiem węgla. Związki te stosuje się na końcu, ponieważ mogą one uszkodzić włókna mięśniowe po przedłużonej ekspozycji. Aby porównać działanie poszczególnych związków, należy przedstawić dane na wykresie.

Kolejnym interesującym zastosowaniem tego preparatu jest pomiar siły generowanej przez mięśnie okrężne. Jeśli jednak w preparacie zastosowano inhibitory połączeń szczelinowych, mogły one uszkodzić mięśnie okrężne, w związku z czym do ich badania należy użyć świeżego preparatu jelita tylnego. Aby odsłonić mięśnie okrężne, należy naciąć rurkę jelita wzdłużnie za pomocą precyzyjnych nożyczek.

Użyj cienkich szpilek, aby bezpiecznie przymocować jeden koniec paska do naczynia. Przymocuj haczyk przetwornika do przeciwległego końca paska. Poddaj preparat działaniu tych samych związków, które były testowane na mięśniach podłużnych; zależność między testowanymi związkami a liczbą i rodzajem skurczów przedstawiono tutaj.

Można sporządzić wykres liczby skurczów w funkcji czasu dla roztworów soli fizjologicznej, serotoniny i glutaminianu. Można również sporządzić wykres liczby skurczów w funkcji siły skurczów wyrażonej w miliwoltach dla roztworów soli fizjologicznej, serotoniny i glutaminianu. Wykresy te można wykonać zarówno dla mięśni podłużnych, jak i okrężnych, aby sprawdzić, czy mięśnie podłużne i okrężne w różnych regionach jelita wykazują odmienne reakcje na poszczególne modulatory.

Powyższe eksperymenty można powtórzyć w różnych obszarach, począwszy od odbytu i kierując się w górę wzdłuż brzucha. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zachowaniu ostrożności, aby nie uszkodzić pęcherzyka pokarmowego pęsetą oraz nie ciągnąć zbyt mocno za przetwornikiem siły. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak rejestracja elektrofizjologiczna mięśni, w celu zbadania innych kwestii, na przykład funkcji i modulacji kanałów jonowych, co może służyć jako model dla innych tkanek w innych modelach zwierzęcych.