Zautomatyzowana analiza Sholla zdigitalizowanej morfologii neuronów w wielu skalach
14 listopada 2010
Opracowaliśmy program komputerowy do analizy morfologii neuronów. W połączeniu z dwoma istniejącymi narzędziami analitycznymi o otwartym kodzie źródłowym, nasz program przeprowadza analizę Sholla oraz określa liczbę neurytów, punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Analizy są wykonywane w taki sposób, aby można było obserwować lokalne zmiany w morfologii neurytów.
W niniejszym materiale wideo przedstawiono procedurę analizy morfologii dendrytów i aksonów, określanych zbiorczo mianem neurytów, z wykorzystaniem programu półautomatycznego w celu obserwacji zmian lokalnych. W pierwszej kolejności wykorzystuje się oprogramowanie neuron J do śledzenia ośmiobitowych obrazów neuronów w formacie TIFF, aby zidentyfikować położenie segmentów neurytów. Następnie używa się oprogramowania Neuron studio do zdefiniowania informacji strukturalnych dotyczących połączeń między neurytami.
Na koniec uruchamiany jest program bonfire w środowisku MATLAB w celu wyekstrahowania danych morfologicznych z komórek, w tym analizy shoal, a także liczby punktów rozgałęzień i zakończeń neurytów. Wyniki wykazują lokalne zmiany w morfologii neurytów na podstawie analizy shoal przeprowadzanej na podregionach drzewa neurytowego. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ręczna analiza shoal, jest półautomatyczny charakter programu, co znacznie zwiększa wydajność analizy i umożliwia audyt danych w celu weryfikacji dokładności analizy.
Procedurę zademonstruje Hirsch AWA, student studiów licencjackich pracujący latem w laboratorium Firesteina. Aby móc wykorzystać program bonfire do analizy cech morfologicznych neurytów na obrazach TIFF w formacie 8-bitowym, należy najpierw pobrać program bonfire, a następnie uzyskać obrazy pojedynczych neuronów. Ustawienia programu muszą zostać dostosowane do rozdzielczości obrazów przeznaczonych do analizy; w sekcji parametrów programu bonfire należy zastąpić aktualną wartość zmiennej picks conversion wartością rozdzielczości posiadanych obrazów.
Aby program bonfire mógł przeanalizować dane, pliki muszą być zorganizowane według określonej struktury, obejmującej folder główny, folder bonfire zawierający pliki MATLAB M programu bonfire, podfoldery dla każdego z różnych wariantów badawczych oraz pliki obrazów komórek wewnątrz folderów poszczególnych wariantów. Należy rozpocząć od przygotowania obrazu do śledzenia. W tym eksperymencie śledzone będą wyłącznie dendryty w celu analizy zmian w morfologii dendrytycznej. Rozpocznij od przygotowania obrazu do śledzenia.
Otwórz obraz, wybierając przycisk open na pasku narzędzi neuron J, a następnie wybierz obraz, który chcesz obrysować. Teraz zmień rozmiar obrazu, wybierając przycisk maximize, aby dostosować jasność i kontrast obrazu w taki sposób, by możliwe było zwizualizowanie wszystkich neurytów; wybierz image na pasku narzędzi neuron J, a następnie wybierz adjust brightness contrast. Aby rozpocząć obrysowywanie, wybierz przycisk add traces na pasku narzędzi neuron J. Obrysuj obwód ciała komórki.
Następnie wybierz przycisk label tracings na pasku narzędzi neuron J i wybierz N one z rozwijanego menu tracing ID, wybierz typ zero six w oknie atrybutów neuron J i zatwierdź przyciskiem Okay. Aby rozpocząć śledzenie neurytów, wybierz przycisk add traces na pasku narzędzi neuron J i dodaj ślad wzdłuż każdej interesującej gałązki neurytu. Najlepiej jest, aby rysowane segmenty kończyły się w każdym punkcie rozgałęzienia, a każda gałąź potomna rozpoczynała się w tym punkcie jako nowy ślad.
Wybierz przycisk zapisu obrysów (save tracings) na pasku narzędzi programu neuron J i zapisz utworzony właśnie obrys w tym samym folderze, w którym znajduje się oryginalny plik obrazu. Następnie wyeksportuj pliki obrysów oraz pliki identyfikatorów obrysów z programu neuron J. Wybierz przycisk eksportu obrysów (export trace) na pasku narzędzi neuron J. Teraz w oknie dialogowym eksportu neuron J wybierz opcję plików tekstowych rozdzielonych tabulatorami w osobnych plikach dla każdego obrysu (tab delimited text files separate file for each tracings) i zatwierdź przyciskiem OK, pozwalając programowi neuron J na automatyczny wybór nazw plików oraz miejsca zapisu.
Wybierz przycisk measure tracings na pasku narzędzi neuron J, a następnie wybierz opcję display tracings measurements w oknie pomiarów neuron J i kliknij run. Wybierz Select file w oknie śladów neuron J, a następnie wybierz save as i zapisz plik. Nazwa pliku musi być dokładnie taka sama jak nazwa oryginalnego pliku obrazu, po której następuje podkreślnik info, i nie powinna zawierać trzyletniego rozszerzenia pliku. Upewnij się, że komputer nie dodaje automatycznie rozszerzenia pliku XLS.
Jeśli tak, rozszerzenie pliku musi zostać usunięte ręcznie. Najpierw zreorganizuj foldery za pomocą funkcji bonfire load, otwierając program MATLAB i klikając przycisk trzech kropek w prawym górnym rogu okna poleceń. Wybierz folder bonfire w swoim folderze głównym w oknie przeglądania folderów, wpisz bonfire load w oknie poleceń i naciśnij enter.
W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkiem, który chcesz przeanalizować, i zatwierdź wybór przyciskiem OK. Spowoduje to reorganizację struktury folderów poprzez utworzenie podfolderów komórek zawierających wszystkie dane dla każdej poszczególnej komórki. Aby teraz utworzyć pliki bonfire_NDF2sWC w formacie filename_premium.swc, wpisz bonfire_NDF2sWC w oknie poleceń i naciśnij enter.
W oknie przeglądania folderów wybierz ten sam folder warunków, który został właśnie zreorganizowany za pomocą bonfire load, a następnie zatwierdź wybór. Spowoduje to utworzenie pliku WC w każdym folderze komórek dla wybranej warunki. Każdy folder komórek będzie zawierał pięć plików.
Oryginalny obraz TIF, plik NDF, plik z informacjami podkreślenia, plik identyfikatora śladu, plik TXT oraz plik swc. Przed rozpoczęciem korzystania z programu Neuron Studio zalecamy zapoznanie się z jego funkcjami i skrótami klawiszowymi. Program posiada doskonałą internetową instrukcję obsługi, a znajomość skrótów klawiatury pozwoli zaoszczędzić dużo czasu.
Aby rozpocząć, otwórz program Neuron Studio i wybierz opcję otwierania pliku na pasku narzędzi Neuron Studio, odszukaj obraz TIF neuronu, który chcesz edytować, i otwórz go. Wybierz ustawienia uruchamiania (run settings) i wprowadź wartość 1 w każdym z trzech pól.
W oknie rozmiaru woksela wybierz opcję importu pliku s wc. Wybierz odpowiedni plik s WC, który odpowiada plikowi, nad którym chcesz pracować. Plik obrazu zostanie teraz nałożony na obraz śladu.
Ciało komórki powinno zostać zaznaczone czerwonym okręgiem w celu powiązania neurytów. Użyj narzędzia do neurytów, aby połączyć węzły w taki sposób, aby każdy punkt rozgałęzienia reprezentowany przez żółte węzły tworzył tylko dwie gałęzie. Wszystkie ślady muszą być ciągłe i połączone z ciałem komórki.
Aby wyeksportować dane z programu Neuron Studio, należy wybrać plik, zapisać neuryty i zapisać je pod domyślną nazwą, aby sprawdzić błędy w plikach typu swc za pomocą polecenia bonfire trace. Wpisz to polecenie w oknie wiersza poleceń i naciśnij enter. W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkiem zawierający dane, które zostały właśnie przetworzone, a następnie zatwierdź wybór przyciskiem OK, aby sprawdzić, czy w którymkolwiek z obrazów w folderze występują błędy.
Program wygeneruje obrazy wskazujące lokalizację błędu w celu wyekstrahowania danych morfologicznych z plików dot S WC. Wpisz bonfire w oknie poleceń i naciśnij enter. W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkiem, który chcesz przeanalizować, a następnie zatwierdź wybór dla każdego z interesujących nas neuronów.
Analiza bonfire wygeneruje wykres morfologii neuronów wraz z pierścieniami ramion wykorzystanymi w analizie. Dodatkowo polecenie bonfire wygeneruje plik MAT zawierający wszystkie informacje morfologiczne uzyskane z analizy. Aby wyświetlić wstępne wykresy danych, wpisz bonfire w oknie poleceń MATLAB, wybierz w oknie przeglądania folderów folder z warunkiem, który chcesz przejrzeć, a następnie kliknij OK.
Okno przeglądania folderów zamknie się tymczasowo, a następnie otworzy ponownie, umożliwiając wybór dodatkowych warunków. Po wybraniu warunków należy kliknąć przycisk anuluj, aby wyjść z procesu wyboru. Program Bonfire wyświetli wykresy podsumowujące, zawierające dane z wybranych folderów z warunkami; aby wyeksportować dane morfologiczne do programu Excel, należy wpisać polecenie bonfire Export w oknie poleceń programu MATLAB.
W oknie przeglądania folderów wybierz folder z warunkiem zawierający dane, które chcesz wyeksportować, i zatwierdź wybór przyciskiem OK. Funkcja eksportu programu bonfire utworzy pliki Excel z danymi morfologicznymi i umieści je w wybranym folderze z warunkiem. Teraz przedstawimy przykład danych wygenerowanych przez program bonfire dla zbioru danych zawierającego dwa warunki.
Poniżej przedstawiono przykładowe odwrócone obrazy dla obu warunków. Na obrazach tych widać, że w warunku pierwszym znajduje się więcej dendrytów niż w warunku drugim. Zjawisko to można zaobserwować również na szeregu wykresów generowanych przez program bonfire.
Ponieważ program bonfire przeprowadza analizę w podregionach dendrytów, zwiększoną liczbę dendrytów w warunkach pierwszych można łatwo zidentyfikować; wykreślenie krzywej Sholl dla całkowitego drzewa dendrytycznego wykazuje, że neurony w warunkach pierwszych mają więcej dendrytów w obszarach dystalnych względem ciała komórki. Wykreślenie średniej liczby punktów rozgałęzień i punktów końcowych na komórkę pokazuje, że w warunkach pierwszych występuje więcej zarówno punktów rozgałęzień, jak i punktów końcowych niż w warunkach drugich. Przedstawiono średnią liczbę wypustek na komórkę dla dendrytów rzędu pierwszego, drugiego, trzeciego lub wyższych. W warunkach pierwszych stwierdzono więcej dendrytów trzeciego i wyższych rzędów; wykreślenie średniej liczby wypustek na komórkę dla dendrytów korzeniowych, pośrednich i końcowych wykazuje, że w warunkach pierwszych znajduje się więcej wypustek pośrednich lub końcowych niż w warunkach drugich.
Przedstawiono tutaj krzywe analizy shoal specyficzne dla tożsamości segmentów, w których segmenty zostały pogrupowane jako pierwotne, wtórne lub trzeciorzędne i wyższe. Wzrost liczby dendrytów trzeciorzędnych występuje dystalnie względem ciała komórki dla neuronów w warunkach pierwszych. Przedstawiono krzywe analizy shoal specyficzne dla tożsamości segmentów, w których segmenty zostały pogrupowane jako segmenty korzeniowe, segmenty pośrednie lub segmenty końcowe.
Wzrost liczby dendrytów pośrednich i końcowych w wariancie pierwszym występuje dystalnie w stosunku do ciała komórki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat przeprowadzania analizy shoal przy użyciu programu bonfire w celu obserwacji lokalnych zmian w neuromorfologii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia półautomatyczny program zaprojektowany do analizy morfologii neurytów, w tym dendrytów i aksonów. Program rozszerza możliwości istniejących narzędzi poprzez przeprowadzanie analizy Sholla i kwantyfikację charakterystyki neurytów, co umożliwia obserwację lokalnych zmian morfologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Morfologia neurytów
- Analiza komputerowa
Wstęp
- Neuryty są kluczowe dla łączności i funkcji neuronów.
- Tradycyjne metody analizy neurytów mogą być czasochłonne i mniej dokładne.
- Istniejące narzędzia open-source stanowią podstawę do zautomatyzowanej analizy.
- Analiza Sholla jest powszechną techniką stosowaną do oceny rozgałęzień neurytów.
Cel badania
- Opracowanie programu automatyzującego analizę morfologii neurytów.
- Zwiększenie wydajności i dokładności analizy neurytów w porównaniu z metodami manualnymi.
- Umożliwienie badaczom obserwacji lokalnych zmian w strukturze neurytów.
Zastosowane metody
- Oprogramowanie Neuron J do śledzenia segmentów neurytów na obrazach.
- Oprogramowanie Neuron Studio do definiowania łączności strukturalnej między neurytami.
- Program Bonfire w środowisku MATLAB do ekstrakcji danych morfologicznych.
- Analiza Sholla do kwantyfikacji cech neurytów, takich jak punkty rozgałęzień i zakończenia.
Główne wyniki
- Program z powodzeniem identyfikuje i analizuje morfologię neurytów.
- Lokalne zmiany w strukturze neurytów zaobserwowano za pomocą analizy Sholla.
- Podejście półautomatyczne znacząco zwiększa wydajność analizy.
- Dokładność danych może zostać zweryfikowana, co zwiększa wiarygodność wyników.
Wnioski
- Opracowany program stanowi niezawodne narzędzie do analizy morfologii neurytów.
- Rozwiązuje on ograniczenia tradycyjnych metod analizy manualnej.
- Podejście to może ułatwić dalsze badania nad strukturą i funkcją neuronów.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Dokładna kwantyfikacja morfologii neurytów wspiera walidację celów w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi, umożliwiając wykrycie zmian strukturalnych związanych z patofizjologią. Zautomatyzowana analiza Sholla zwiększa pewność predykcyjną w modelach przedklinicznych poprzez redukcję zmienności i zwiększenie przepustowości przesiewowej analizy morfologicznej. Podejście to ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie zmian w arboryzacji dendrytów z efektami funkcjonalnymi w systemach istotnych dla danej choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację wzorców rozgałęzień dendrytów jako funkcjonalnych wskaźników stanu zdrowia neuronów.
- Wartość operacyjna: Ogranicza błąd eksperymentatora i zwiększa powtarzalność oceny morfologicznej w różnych warunkach doświadczalnych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez identyfikację związków, które przywracają strukturę lub zapobiegają fragmentacji dendrytów w modelach chorób.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Generuje zstandaryzowane dane ilościowe, w tym liczbę punktów rozgałęzień, końcówek terminalnych oraz wskaźniki interakcji Sholla, przeznaczone do przesiewu wysokotreściowego (high-content screening).
- Skalowalność: Półautomatyczny przepływ pracy umożliwia przetwarzanie wielu drzew neurytowych na warunek, co wspiera kampanie przesiewowe o średniej przepustowości.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Wyniki mogą zostać wyeksportowane do programu Excel w celu integracji z dalszą analizą statystyczną i profilowaniem odpowiedzi na związki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Bezpośrednio zastosowalne w modelowaniu patologii dendrytów obserwowanych w chorobie Alzheimera, schizofrenii oraz zaburzeniach poznawczych.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia spójną ocenę morfologiczną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną z wykorzystaniem ustandaryzowanych parametrów Sholla.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Ułatwia podejmowanie decyzji typu go/no-go w oparciu o wskaźniki regeneracji strukturalnej skorelowane z powrotem funkcji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków jako narzędzie do przesiewu fenotypowego w celu oceny integralności neurytów, stanowiąc ogniwo pomiędzy testami zaangażowania celu a funkcjonalnymi odczytami elektrofizjologicznymi.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez dostarczanie ilościowych danych morfologicznych w celu wyjaśnienia efektów specyficznych dla szlaków sygnałowych w strukturze neurytów.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych parametrów neurytów, które umożliwiają niezawodną ocenę związków w formatach wielodołkowych.
- Analityka: Generuje dane interakcji Sholla oraz liczbę neurytów, co pozwala na statystyczne porównanie efektów zabiegów w zakresie złożoności dendrytów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie podłużnego śledzenia przebudowy dendrytów w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia możliwość wielokrotnego wykorzystania metody oceny morfologii neurytów w wielu projektach i obszarach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję szumów w danych morfologicznych dzięki półautomatyzacji.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność analizy neurytów, skracając czas analizy pojedynczej próbki i umożliwiając badania na większych kohortach.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez przyspieszenie redukcji ryzyka na etapie przedklinicznym i zmniejszenie wskaźnika niepowodzeń wynikających z nieprzewidzianej toksyczności strukturalnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektów w oparciu o skorygowane ryzyko, wykorzystując obiektywne i mierzalne punkty końcowe morfologii neurytów.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest znajomość programów ImageJ, Neuron Studio oraz MATLAB w celu wykonania pełnego procesu analizy.
- Metoda zależy od dostępu do mikroskopii fluorescencyjnej oraz systemów akwizycji obrazów TIFF 8-bitowych.
- Konieczne jest zastosowanie ustandaryzowanych ustawień rozdzielczości obrazu oraz struktury folderów w celu zapewnienia kompatybilności z programem Bonfire.
- Proces obejmuje etapy ręcznego obrysowywania, które wymagają przeszkolenia w celu zapewnienia spójnej segmentacji neurytów.
- Metoda jest ograniczona do analizy obrazów 2D; rekonstrukcja 3D wymagałaby dodatkowych narzędzi obliczeniowych.
Najczęściej zadawane pytania z zakresu biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Title
0:20
Introduction
1:20
Preparations for Automated Sholl Analysis
2:14
Tracing Neurons in NeuronJ
4:52
Using Bonfire to Build Preliminary .swc Files from NeuronJ Data
6:27
Using NeuronStudio to Finalize .swc Files
7:57
Using 'bonfire' to Extract Morphological Data and 'bonfire_results' to View the Data
9:06
Using 'bonfire_export' to Export Data into Excel
11:21
Conclusion
