Western blotting: od przygotowania próbki do detekcji

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykazanie łatwości wykonywania analizy Western blot przy użyciu odpowiednich produktów. Po przygotowaniu próbek białka są rozdzielane na podstawie wielkości, a następnie przenoszone na fazę stałą. Następnie białka są wykrywane za pomocą przeciwciał; zastosowanie właściwych protokołów oraz wysokiej jakości, ekonomicznych odczynników pozwala na uzyskanie ulepszonych wyników analizy Western blot.

Witajcie, jestem Jesse Luhan, naukowiec ds. badań i rozwoju w EMD Chemicals w San Diego w Kalifornii. EMD jest filią firmy Merck, KGaA w Darmstadt w Niemczech. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę western blottingu.

Zacznijmy zatem. Pierwszym krokiem w western blottingu jest przygotowanie próbek. Rozpocznij przygotowanie próbek od wirowania komórek w celu ich osadzenia, stosując niską prędkość wirowania, na przykład przez pięć minut przy 2 500 ×g.

Po wirowaniu odlej nadsącz z osadów komórkowych. Dokładnie resuspenduj komórki w odczynniku do ekstrakcji białek cyto buster, stosując 150 µL na 10⁶ komórek. Inkubuj próbkę w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie, po odwirowaniu, wiruj próbkę przez pięć minut przy 16 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś oczyszczone SNA do nowej probówki i przystąp do analizy. Po oznaczeniu stężenia białka w próbce, przygotuj ją do nałożenia na żel w celu denaturacji białka.

Należy użyć buforu do próbek zawierającego jonowy detergent denaturujący, taki jak dodecylosiarczan sodu lub SDS. Mieszaninę należy gotować w temperaturze od 95 do 100 °C przez pięć minut. Dzięki zastosowaniu dostępnego komercyjnie gotowego żelu białka mogą zostać szybko rozdzielone na podstawie masy cząsteczkowej.

Napełnij układ elektroforetyczny buforem do prowadzenia, który można przygotować z odczynników dostępnych w linii chemicznej Omni PU. Na pierwszą ścieżkę w dołku nałóż marker białkowy trail mix. Marker ten posiada trzy pasma referencyjne, które umożliwiają monitorowanie przebiegu elektroforezy.

Po zabarwieniu żelu widocznych jest 10 prążków o masach od 10 do 225 kilo Daltons. Należy nanieść zdenaturowaną próbkę do pozostałych oczek. Elektroforezę należy prowadzić przy napięciu 220 volt przez jedną godzinę.

Po rozdzieleniu białek należy zabarwić żel błękitem Coomassie, aby upewnić się, że białka migrowały równomiernie i jednorodnie, wykorzystując szybki barwnik oraz barwnik ultrasensytywny, który jest gotowy do użycia bez dodatku SDS. Barwienie jest niezbędne, ponieważ białka posiadające ładunek elektryczny mogą być indukowane do przemieszczania się przez żel w polu elektrycznym, dzięki czemu mogą zostać przeniesione w polu elektrycznym z żelu na membranę, taką jak nitrocelulozowa lub PVDF. W przypadku stosowania membran PVDF, należy namoczyć membranę w metanolu przez kilka minut, a następnie przeprowadzić równoważenie w lodowatym buforze do transferu przez pięć minut. Żel należy również namoczyć przez kilka minut w lodowatym buforze do transferu; równoważenie zapobiega kurczeniu się żelu podczas transferu.

W przypadku transferu mokrego należy przygotować układ warstwowy („sandwich”) składający się z żelu i membrany umieszczonych pomiędzy gąbkami i papierem. Następnie, upewniając się, że między żelem a membraną nie powstały pęcherzyki powietrza, należy ściśle zacisnąć cały układ. Układ warstwowy należy zanurzyć w buforze do transferu i przyłożyć pole elektryczne.

Ujemnie naładowane białka będą przemieszczać się w stronę dodatnio naładowanej elektrody. Membrana następnie je zatrzymuje, wiąże i zapobiega ich dalszemu przemieszczaniu się. Po zakończeniu transferu należy przeprowadzić wizualizację białek, aby upewnić się, że transfer przebiegł równomiernie i bez powstania pęcherzyków powietrza.

Można to łatwo przeprowadzić z wykorzystaniem barwnika do Western blot red alert. Barwnik ten jest gotowy do użycia, a odbarwianie można łatwo wykonać w wodzie. Przedstawiony jest żel po odbarwieniu poprzez płukanie w wodzie; przed inkubacją membrany z przeciwciałami, membrana zostaje zablokowana.

Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu, należy zablokować membranę wysokiej jakości odczynnikami blokującymi. Aby uniknąć zwiększenia tła, inkubuj membranę w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu, a następnie po inkubacji przemyj membranę trzy razy w TBST lub PBST. Bufor te można łatwo i wygodnie przygotować, stosując odpowiednio tabletki TBS tween i tabletki PBS tween.

Po zablokowaniu i przemyciu membrany można przystąpić do inkubacji z przeciwciałem pierwszorzędowym. Należy nanieść przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze, w tym jeden z zestawów do wzmacniania sygnału (signal boost), co pozwala na znaczne zwiększenie intensywności sygnału. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe w roztworze pierwszym i inkubować membranę przez jedną godzinę.

Po inkubacji nie ma potrzeby dodawania kolejnych czynników blokujących. Przemyć membranę buforem TBST. Następnie inkubować membranę przez jedną godzinę z przeciwciałem wtórnym rozcieńczonym w roztworze dwa signal boost.

Na koniec ponownie przemyj membranę kilka razy buforem TBST przed naniesieniem koniugatów HRP. W tym etapie tradycyjnie stosuje się detekcję przeciwciał wtórnych za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji (ECL). Wykorzystano odczynnik ECL typu rapid step, który nie wymaga mieszania luminolu z wzmacniaczem.

Wystarczy spryskać membranę kilka razy, inkubować przez dwie minuty, a następnie wywołać ją za pomocą filmu rentgenowskiego. Metoda Rapid Step oferuje czułość na poziomie niskich pikogramów oraz mniejszą intensywność sygnału do dwóch godzin po dodaniu substratu. Markery białkowe Trail mix umożliwiają śledzenie białek podczas elektroforezy w porównaniu ze standardowymi protokołami Western blot.

Wzmocnienie sygnału (Signal Boost) pozwala na uzyskanie większego zakresu dynamicznego i czułości. Wreszcie, wyższą czułość można osiągnąć, stosując odczynnik Rapid zamiast tradycyjnych odczynników ECL. Przedstawiliśmy właśnie sposób wydajnego i kosztowo efektywnego przeprowadzania Western blindingu z wykorzystaniem kompleksowej gamy produktów.

Pamiętajcie, że jakość otrzymanych wyników zależy od jakości użytych odczynników. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.