Urządzenie mikrofluidyczne do odtwarzania mikrośrodowiska nowotworu in vitro

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie wykonania i działania urządzenia mikrofluidycznego, które odtwarza mikrośrodowisko nowotworowe in vitro i może być wykorzystywane do testowania leków chemioterapeutycznych. Jest to urządzenie mikrofluidyczne. Urządzenie to może być przydatne w następujących obszarach: łatwe testowanie leków chemioterapeutycznych in vitro.

Urządzenie to zapewnia spójne i dokładne wyniki w badaniach trójwymiarowej tkanki nowotworowej, stanowiąc bardzo precyzyjne odwzorowanie guza in vivo. Nowotwory występują w mikrośrodowiskach 3D, a możliwość przeprowadzania testów w takim środowisku ma istotne znaczenie. Pierwszym krokiem procedury jest montaż urządzenia, który obejmuje wykonanie chipa mikroprzepływowego metodą miękkiej litografii, wykonanie otworów w wlotach i wylotach, przyklejenie chipa do szkiełka przedmiotowego oraz podłączenie rurek doprowadzających i odprowadzających ciecz.

Następnie, z wykorzystaniem metody wiszącej kropli, generowane są jednorodne wielokomórkowe sferoidy nowotworowe do użycia w urządzeniu. Sferoidy są następnie wprowadzane do urządzenia, po czym dodaje się czynniki indukujące apoptozę, odczynniki detekcyjne oraz leki chemioterapeutyczne. Na koniec przeprowadzana jest mikroskopia poklatkowa, a następnie matematyczna estymacja współczynników dyfuzji leku w celu ilościowego określenia zdolności penetracji środka chemioterapeutycznego.

Ostatecznie, dzięki zastosowaniu fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, można uzyskać wyniki obrazujące wzrost tkanki w urządzeniu, tworzenie się heterogenicznych mikrośrodowisk w obrębie tkanki oraz dyfuzję leku do tkanki. Ograniczona penetracja leków przeciwnowotworowych do guzów litych jest istotną przyczyną ich nieskuteczności. Większość obecnych modeli testowania leków przeciwnowotworowych nie oddaje trójwymiarowej natury guzów litych.

Opracowaliśmy urządzenie mikrofluidyczne składające się z stale perfundowanych trójwymiarowych tkanek nowotworowych. Model ten dokładniej odwzorowuje dostarczanie leków do guzów litych oraz ich klirens systemowy. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe stanowią dobrze ugruntowany model trójwymiarowych tkanek nowotworowych.

W niniejszej procedurze zastosowano metodę wiszącej kropli w celu wytworzenia sferoidów do wykorzystania w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda ta pozwala na uformowanie jednolitych sferoidów w krótkim czasie. Testowanie leków chemioterapeutycznych in vitro w trójwymiarowych tkankach może pomóc w bardziej efektywnym przesiewaniu leków w porównaniu do monowarstw komórek.

Wymieszać PDMS i czynnik sieciujący z elastomeru silikonowego w stosunku wagowym dziewięć do jednego. Następnie wylać tę mieszaninę na matrycę, aby utworzyć warstwę o grubości 4 mm. Odgazować, aby usunąć pęcherzyki powietrza, a następnie utwardzać w temperaturze 60 °C przez pięć godzin.

Oddziel utwardzony PDMS od formy, aby uzyskać stempel z odwzorowaniem struktur przepływu na elastomerze. Następnie, używając wycinaka do biopsji o średnicy 1,5 mm zamontowanego na wiertarce, wyciśnij otwory wlotowe i wylotowe. Usuń wszelkie pozostałości materiału.

Stronę z wzorem stempla oraz czystą lamelkę szklaną poddaj działaniu plazmy tlenowej przez osiem minut. W urządzeniu do trawienia plazmą tlenową natychmiast doprowadź do kontaktu potraktowanych powierzchni, aby utworzyć między nimi wiązanie. Przechowuj tak przygotowany zespół w temperaturze 60 °C na podgrzewaczu do lamelek przez co najmniej pięć godzin.

Aby wzmocnić połączenie, podłącz rurkę PTFE o średnicy wewnętrznej 0,032 inches do wlotów i wylotów urządzenia mikrofluidycznego. W celu zapewnienia łatwego przepływu bez ryzyka uszkodzenia, zastosowano interfejs składający się z męskich złączy lure lock przymocowanych do żeńskich złączy lure lock z karbem. Na koniec przygotuj układ przepływowy, używając zaworów odcinających i łącznika w kształcie litery Y, a następnie zamontuj urządzenie na mikroskopie. Po zamontowaniu urządzenia podłącz rurki do odpowiednich wlotów i wylotów, aby ukończyć konfigurację przepływu.

Jak pokazano na tej rycinie, taka konfiguracja zapewnia łatwość i wszechstronność umieszczania sferoidu w urządzeniu lub tworzenia przepływu pożywki przez urządzenie w celu jego unieruchomienia. Należy otworzyć zawór wlotowy do pakowania VPN oraz zawór wylotowy do pakowania VP out. Sferoid może następnie przejść przez wlot i wpłynąć do komory hodowlanej, gdzie słupek w tej komorze utrzyma guz na miejscu podczas przepływu pożywki.

Zamknij zawory upakowania i otwórz zawór wlotowy przepływu VF in oraz zawór wylotowy przepływu VF out, aby zainicjować tworzenie jednorodnych PHE. Wykorzystując metodę wiszącej kropli, poddaj komórki lodu trypsynizacji w komorze laminarnej. Wyjmij otrzymane komórki po trypsynizacji z wirówki.

Rozcieńcz roztwór stokowy do pożądanego stężenia, korzystając z tabeli 1. Następnie zdejmij pokrywkę płytki 48-dołkowej i połóż ją do góry dnem. W sterylnej komorze przepływu laminarnego napełnij każdy dołek płytki 1 mL sterylnej wody.

Aby utrzymać wilgotność, nanieś 20 µL kropli rozcieńczonego roztworu komórek w każdym okrągłym obszarze na przykrywce. Używając mikropipety, ostrożnie odwróć przykrywkę i umieść ją na płytce, upewniając się, że krople nie dotykają krawędzi dołków. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C.

Czas inkubacji w zależności od rodzaju użytych komórek określono w tabeli 1; w każdej wiszącej kropli uformuje się steroid. Należy rozpocząć od wysterylizowania urządzenia poprzez przepłukanie go 70% ethanol poprzez wlot przepływu. Następnie należy przepłukać urządzenie kolejno PBS, a potem pożywką do hodowli komórkowej buforowaną H-E-P-E-S.

Pozostaw strzykawkę z pożywką, podłącz ją do drenu. Następnie nabierz od dwóch do trzech jednostek Steroids do strzykawki. Aby usunąć pęcherzyki powietrza, podłącz strzykawkę do wlotu pakowania urządzenia.

Otwórz zawór wlotowy VPN i zamknij VFN, otwórz zawór wylotowy VP out i zamknij VF out. Trzymaj strzykawkę do pakowania pionowo, z igłą skierowaną w dół. Obserwuj, aż steroid opadnie na dno strzykawki do złącza luer-lock igły.

Naciśnij tłok strzykawki do upakowania i obserwuj, jak PHE wpływa do rurki i przepływa do urządzenia, ponieważ otwarty jest tylko zawór wylotowy upakowania. Steroid wpłynie do komory urządzenia i zostanie zatrzymany przez słupki z tyłu. Po dostaniu się do komory sferoid S dopasuje się do jej kształtu i przyjmie geometrię prostokątną.

Zamknąć zawór wlotowy VPN i zawór wylotowy VP out, a następnie zamocować strzykawkę przepływową SF na pompie strzykawkowej. Pompa ta jest sterowana komputerowo za pomocą programu syringe pump pro; otworzyć zawór wlotowy VFN oraz zawór wylotowy VF out. Rozpocząć przepływ medium do urządzenia z prędkością 3 µL/min.

Po 24-godzinnej inkubacji sferoidów wprowadza się odczynniki do wykrywania apoptozy. Przed podaniem czynników wykrywających apoptozę lub czynników terapeutycznych należy odczekać do 24 godzin, aż sferoidy osiągną stan równowagi i ustanowią się gradienty składników odżywczych oraz mikrośrodowiska. Następnie należy zamknąć zawór VFN.

Zatrzymaj pompę strzykawkową. Wyjmij strzykawkę z pompy i zastąp ją strzykawką zawierającą medium z 0,25 µL/ml markera aktywności kaspazy 3 CASPglow red. Przepłucz urządzenie tym roztworem, ręcznie przepuszczając przez nie 0,7 ml cieczy.

Następnie zamontuj strzykawkę w pompie. Wznów przepływ i otwórz zawór VFN. W ciągu od pięciu do ośmiu godzin czynnik wykrywający apoptozę Cask Glove Red Active CPH Phase Three dyfunduje do tkanki i fluorescuje jaśniej w obszarach apoptotycznych. Odczynnik wykrywający apoptozę w tym stężeniu jest utrzymywany we wszystkich kolejnych roztworach przepływowych.

Doksorubicynę wprowadza się od pięciu do ośmiu godzin po wprowadzeniu czynników wykrywających apoptozę. Preparat ten jest usuwany z układu poprzez przepłukiwanie. Aby dodać środki chemioterapeutyczne, należy postępować zgodnie z procedurą wykrywania apoptozy, aby wprowadzić 10 µM chlorowodorku doksorubicyny.

Następnie zastąp strzykawkę z preparatem strzykawką zawierającą 0,7 milliliters medium. Kontynuuj przepływ środka terapeutycznego przez ustalony czas. Następnie zamknij zawór VFN i wyłącz pompę strzykawkową.

Zdejmij strzykawkę z preparatem z pompy strzykawkowej i zastąp ją strzykawką zawierającą 0,7 milliliters pożywki. Pozostaw przepływ świeżej pożywki przez 24 do 36 hours, stale monitorując tkankę pod mikroskopem. Cały proces akwizycji dla mikroskopii time-lapse został zautomatyzowany za pomocą dostosowanego skryptu w programie IP lab; obrazy w świetle przechodzącym i fluorescencyjne PAX Foid pozyskiwano przy powiększeniu 10 x co 30 minutes. W celu matematycznego oszacowania współczynników dyfuzyjności leku, pierwszym krokiem jest wygenerowanie średnich liniowych profili intensywności fluorescencji za pomocą programu ImageJ. Wybierz prostokątny obszar zainteresowania, lub ROI, obejmujący tkankę w komorze.

Użyj polecenia plot profile, aby wygenerować profil średnich intensywności w funkcji odległości od kanału przepływowego. Powtórz tę czynność dla maksymalnie trzech różnych punktów czasowych. Następnie od otrzymanych profili intensywności odejmij średnią intensywność fluorescencji tła i znormalizuj każdy profil, korzystając z odpowiadającej mu intensywności maksymalnej, aby otrzymać C w funkcji X i T. Gdzie C to znormalizowane stężenie doksorubicyny, a wartość C zmienia się w zakresie od zera do jeden.

Kolejnym krokiem jest ocena efektywnego współczynnika dyfuzji doxorubicyny w tkance nowotworowej. Dyfuzję można przedstawić za pomocą następującego równania, w którym ERFC jest dopełniającą funkcją błędu. X to odległość w głąb tkanki od kanału, a T to czas po wprowadzeniu doxorubicyny.

W każdym rozważanym punkcie czasowym należy zastosować następujący schemat iteracyjny. Przyjmij wartość szacunkową dla D. Oblicz prawą stronę równania w każdym położeniu X. Oblicz sumę kwadratów błędów między obiema stronami, a następnie zmodyfikuj D, aby zminimalizować średnią wartość residuum.

Optymalne wartości D uzyskane w każdym punkcie czasowym służą do oszacowania średniego efektywnego współczynnika dyfuzji doksorubicyny w tkance. Urządzenia mikroprzepływowe zapewniły optycznie dostępne komory hodowlane o wymiarach 1 mm x 0,3 mm x 0,15 mm do wzrostu trójwymiarowej tkanki nowotworowej. Metoda wiszącej kropli pozwoliła na szybkie formowanie PHE nowotworowych o spójnym rozmiarze i kształcie z kilku linii komórkowych.

PHE były z powodzeniem hodowane na urządzeniu do trzech dni. Wzrost w komorach wiązał się z powtarzalną modyfikacją mikrośrodowisk. W obrębie PHE apoptoza występowała rzadziej w komórkach znajdujących się w bliskim sąsiedztwie kanału przepływowego, a częściej w głębszych warstwach tkanki.

Urządzenie zostało wykorzystane do oszacowania współczynnika dyfuzji doxorubicyny w tkance nowotworowej. Wartość uzyskana eksperymentalnie była zgodna z wartością zgłoszoną wcześniej dla raka piersi u ludzi. Podczas przeprowadzania tej procedury należy zachować szczególną ostrożność w utrzymaniu sterylności podczas wprowadzania PHE do urządzenia, ponieważ czynność ta musi być wykonana poza inkubatorem do hodowli komórkowych.

Strzykawki w dygestorium oraz końcówki rurek obficie spryskać etanolem, aby zapewnić sterylność. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo zrozumieć rolę ograniczonej penetracji leków do guzów. Przedstawiliśmy technikę pozwalającą na symulację dostarczania i systemowego usuwania leków z trójwymiarowych tkanek nowotworowych oraz ilościowe określenie ich penetracji.

Wyeliminowanie leków o słabej przenikalności znacząco usprawni proces opracowywania leków przeciwnowotworowych.