Endotelializowane układy mikrofluidyczne do badania oddziaływań naczyniowych w chorobach hematologicznych

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie urządzenia mikrofluidycznego pokrytego komórkami śródbłonka. Jest to realizowane poprzez najpierw wykonanie formy mikrofluidycznej. Drugim krokiem jest stworzenie kanału z PDMS.

Następnie komórki śródbłonka są wysiewane do urządzenia. Ostatnim krokiem jest hodowla komórek wewnątrz urządzenia. W końcowym etapie urządzenia mikroprzepływowe pokryte komórkami śródbłonka są wykorzystywane do wykazania oddziaływań międzykomórkowych in vitro.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest zapewnienie badaczowi ścisłej kontroli nad warunkami biologicznymi i biofizycznymi oraz kompatybilność z mikroskopią fluorescencyjną. Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat biofizycznych oddziaływań międzykomórkowych w chorobach hematologicznych, można ją również zastosować do badania zjawisk takich jak biologia leukocytów, przerzuty nowotworowe oraz biologia hematopoetycznych komórek macierzystych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ w celu skutecznego osadzenia komórek konieczne jest rygorystyczne kontrolowanie warunków.

W ramach przygotowań do procesu wytwarzania stworzono maskę fotolitograficzną, przesyłając obraz projektu urządzenia mikroprzepływowego wykonany w programie wspomagania projektowania (CAD) do zewnętrznego dostawcy masek. Otrzymana maska składa się z warstwy chromu na szkle sodowo-wapniowym. W tym przypadku szerokość kanału mikroprzepływowego wynosi 30 µm.

Aby rozpocząć wykonanie urządzenia mikroprzepływowego, należy oczyścić czysty wafelek krzemowy roztworem pirania przez 15 minut, a następnie przepłukać go wodą dejonizowaną przez 10 sekund. Następnie wafelek krzemowy zanurza się w kwasie fluorowodorowym na 30 sekund i płucze wodą dejonizowaną przez około 10 sekund. W kolejnym kroku, przy użyciu powlekarki wirówkowej, nanosi się na wafelek fotorezyst micro chem SU 8 20 25, aby uzyskać warstwę o grubości 30 mikronów, stosując prędkość wirowania 3000 obrotów na minutę.

Umieść podłoże pokryte SU 8 20 25 na płycie grzejnej ustawionej na 95 °C przez pięć minut, aby odparować nadmiar rozpuszczalnika. Na tym etapie nie zaleca się stosowania pieca. Następnie nałóż maskę fotolitograficzną na podłoże i naświetl promieniowaniem UV w wyrównywaczu masek (mask liner), aby doprowadzić do sieciowania fotorezystu SU 8 20 25.

Po sieciowaniu umieść podłoże ponownie na płycie grzewczej w temperaturze 95 °C przez dodatkowe pięć minut, aby dalej przyspieszyć polimeryzację fotorezystu SU 8 20 25. Następnie zanurz podłoże w wywoływaczu SU 8, składającym się głównie z PGMEA, na cztery minuty.

Działanie to usunie niesieciowany fotorezyst SU 8 20 25. Przepłucz nowo wywołany wafelek 100% izopropanolu przez 10 sekund, a następnie osusz go za pomocą sprężonego azotu lub pozostawiając rozpuszczalnik do odparowania z wafla w czystej dygestorium przez kilka minut. Teraz przymocuj wysuszony wafelek taśmą do środka szalki Petriego, uważając, aby taśmę umieścić na krawędziach wafla.

Na koniec nanieś pipetą 500 µL sigma coat na wafelek. Przykryj szalkę Petriego pokrywką, a następnie zakręć szalką, aby zapewnić całkowite pokrycie wafelka. Zdejmij pokrywkę i pozostaw wafelek do wyschnięcia na kilka minut, aż cały rozpuszczalnik odparuje.

Po zmieszaniu polimeru PDMS z utwardzaczem w stosunku masowym 10:1, usuń pęcherzyki powietrza za pomocą desykatora próżniowego przez kilka minut do jednej godziny, w zależności od mocy dostępnego systemu próżniowego. Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza wlej mieszaninę do naczynia w taki sposób, aby pokryła ona wafer i powierzchnię naczynia. Pozwoli to na utworzenie warstwy PDMS o grubości około 5 mm.

Należy również przygotować cienki, gładki fragment PDMS o grubości 1 mm. Następnie mieszaninę utwardza się w piekarniku w temperaturze 60 °C przez noc. Następnego dnia, używając noża lub skalpela, należy wyciąć obszar wokół wafla i wyjąć kilka mikroprzepływowych urządzeń z PDMS.

Następnie dotnij arkusz, aby wyizolować poszczególne urządzenia. Dotnij arkusz PDMS tak, aby był nieco większy niż urządzenie mikroprzepływowe. Teraz użyj wiertarki ręcznej Harris unicorn lub podobnego narzędzia, aby wykonać otwory wlotowe i wylotowe w urządzeniu mikroprzepływowym.

Następnie oczyść powierzchnie urządzenia mikroprzepływowego oraz arkusza za pomocą taśmy klejącej. Potem użyj urządzenia do plazmowania, aby poddać powierzchnie urządzenia mikroprzepływowego i arkusza PDMS działaniu plazmy tlenowej przez 30 seconds. Plazma tlenowa tworzy reaktywne formy chemiczne na odsłoniętej powierzchni PDMS, które wiążą się podczas bezpośredniego kontaktu fizycznego.

Następnie należy napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml, wyposażoną w stępioną igłę o rozmiarze 20 G, roztworem fibronektyny z ludzkiej osocza w PBS o stężeniu 50 µg/ml, a następnie nałożyć odcinek rurki na igłę. Do pierwszej rurki należy wsunąć odcinek rurki o mniejszej średnicy, aby uzyskać ciasne dopasowanie obu elementów.

Następnie przymocuj drugi koniec cieńszej rurki do wlotu urządzenia mikrofluidycznego. Wywrzyj nacisk na strzykawkę, aby całkowicie wypełnić kanały roztworem fibronektyny i utworzyć małą kroplę o objętości 100 µL w porcie wylotowym, co zapewni utrzymanie wilgotności kanałów. Teraz inkubuj urządzenie mikrofluidyczne w inkubatorze z nawilżaczem w temperaturze 37 °C przez 40 do 60 minut.

Po inkubacji podłącz nową strzykawkę wypełnioną PBS do tępej igły. Wywieraj nacisk, aby przepłukać urządzenie mikroprzepływowe PBS. Przygotuj zawiesinę ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (hve) w stężeniu od 500 000 do 2 milionów komórek na mililitr w pożywce do wzrostu komórek śródbłonka z dodatkiem 8% dekstranu.

Dodatek dekstranu zwiększa prawdopodobieństwo, że komórki przylgną i będą pomyślnie hodowane w urządzeniu mikroprzepływowym. Należy napełnić czystą strzykawkę wyposażoną w igłę tępą i szerszą rurkę zawiesiną komórkową, a następnie podłączyć dłuższy odcinek rurki o długości około jednego metra. Kluczowe jest zapewnienie szczelnego dopasowania rurek, aby wyeliminować wycieki na wszystkich połączeniach.

Wypełnij przewody roztworem komórkowym, upewniając się, że w strzykawce oraz we wszystkich przewodach nie ma pęcherzyków powietrza, aby zoptymalizować działanie systemu. Na tym etapie kluczowe jest zapobieganie wszelkim wyciekom oraz przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do systemu. Jakikolwiek wyciek roztworu lub obecność pęcherzyków w medium uniemożliwi prawidłowe osadzenie się komórek śródbłonka.

Po usunięciu wszystkich pęcherzyków powietrza i przepłukaniu całego odcinka rurki zawiesiną komórkową, należy umieścić strzykawkę w pompie, a drugi koniec rurki podłączyć do wlotu układu mikroprzepływowego. Pompa strzykawkowa powinna znajdować się na tej samej wysokości co urządzenie mikroprzepływowe. Długi odcinek rurki należy starannie zwinąć wewnątrz inkubatora, aby zapewnić odpowiednie ogrzanie komórek i pożywki przed ich kontaktem z urządzeniem.

Następnie zawiesinę komórkową wprowadza się do urządzenia mikrofluidycznego z objętościowym natężeniem przepływu 1,23 µL/min przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w naszym systemie. Objętościowe natężenie przepływu 1,23 µL/min odpowiada prędkości wewnątrzkanałowej 1 mm/s w najwęższych kanałach. W przypadku użycia krwi pełnej odpowiada to przybliżonemu naprężeniu ścinającemu przy ściankach wynoszącemu 1 dyn/cm² w tych kanałach.

Po zakończeniu infuzji zawiesiny komórek, należy użyć tej samej pompy strzykawkowej i długiego przewodu z większą strzykawką, aby przez okres od dwóch do ośmiu dni podawać świeżą pożywkę wzrostową z prędkością 1,23 µL/min. Gdy monowarstwa komórek osiągnie pożądany stopień konfluencji, do układu wstrzykuje się krew lub zawiesinę komórek w celu przeprowadzenia eksperymentu. Tutaj przedstawiono urządzenie mikrofluidyczne przed endotelizacją.

Urządzenie mikrofluidyczne zostało wypełnione barwnikiem spożywczym, aby zilustrować rozmiar, skalę i ogólny projekt urządzenia imitującego fizjologię naczyń krwionośnych. Mikroskopia w polu jasnym wykazuje endotelizację urządzenia mikrofluidycznego. Obraz ten został uzyskany mniej niż 48 godzin po zasiewie zgodnie z opisanym protokołem; zoptymalizowana technika perfuzji pozwala komórkom śródbłonka na stworzenie konfluentnej hodowli na całej wewnętrznej powierzchni systemu mikrofluidycznego.

W ciągu 24 do 48 godzin od wysiania komórek. Jak pokazano na tym obrazie konfokalnym, guź mikro naczyniowy na chipie z mikrokanałami przybliża 30 mikronową wielkość naczyń pocapilarnych, które są miejscem większości zdarzeń zatorowych w mikrokrążeniu w anemii sierpowatej. W tym eksperymencie krew pełna od zdrowych pacjentów jest infundowana do urządzenia z mikro naczyniami na chipie w warunkach beztlenowych.

Film ten pokazuje, że przepływ krwi pełnej w naszym endotelialnym systemie mikrofluidycznym jest regularny, łagodny i ciągły, bez obszarów niedrożności mikrokanałów. W tym przypadku krew pełna pobrana od pacjentów z anemią sierpowatą jest infundowana do urządzenia z mikro naczyniami na chipie. W warunkach odtlenowania obserwuje się znaczące zmiany w przepływie krwi, z występowaniem całkowitych okluzji w kilku kanałach.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie wprowadzać pęcherzyków powietrza podczas wymiany przewodów. Gotowe urządzenie jest kompatybilne z mikroskopią fluorescencyjną i może zostać dostosowane do tradycyjnych testów fluorescencyjnych. Technika ta otwiera drogę hematologom eksperymentalnym do prowadzenia badań na pojedynczych komórkach w kontrolowanym środowisku biofizycznym i hemodynamicznym.

Bez pęcherzyków powietrza.