Rejestracje postsynaptyczne w dendrytach aferentnych kontaktujących się z wewnętrznymi komórkami rzęskowymi ślimaka: monitorowanie uwalniania wielopęcherzykowego w synapsie wstążkowej

Ogólnym celem tej procedury jest rejestracja aktywności postsynaptycznej w synapsach aferentnych komórek rzęsnych wewnętrznych. Osiąga się to poprzez uprzednie odsłonięcie nabłonka sensorycznego ślimaka niedawno usuniętego od zdekapitowanego szczura. Drugim krokiem procedury jest umieszczenie wyciętego wierzchołka na zmodyfikowanym szkiełku nakrywce i przeniesienie go do komory rejestracyjnej.

Trzecim krokiem procedury jest zlokalizowanie i uzyskanie dostępu do włókna doprowadzającego za pomocą elektrody rejestrującej. Ostatnim etapem procedury jest utworzenie szczelnego połączenia (seal) z membraną włókna doprowadzającego, a następnie jej przerwanie w celu ustanowienia konfiguracji whole cell techniki patch clamp. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące zdarzenia lub potencjały postsynaptyczne z pojedynczej synapsy wstążkowej za pomocą elektrofizjologii w konfiguracji whole cell patch clamp.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ dyssekcja i przygotowanie tkanki ślimaka są trudne do opanowania, a małe włókna doprowadzające są ciężkie do rozpoznania i uzyskania do nich dostępu. Przed rozpoczęciem dyssekcji przygotuj zmodyfikowane szkiełko nakrywkowe, które będzie utrzymywać preparat na miejscu podczas rejestracji. Używając okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy od 8 do 12 mm, nanieś kroplę częściowo utwardzonego Sylgardu w pobliżu krawędzi szkiełka.

Umieść grubszy koniec cienkiej szpilki entomologicznej na szkiełku nakrywkowym. Mocno przyciśnij szpilkę do szkła. Za pomocą pęsety podgrzej osłonę progu przeciwko rozgrzanej cewce, aby ją utrwalić.

Przygotować od 10 do 20 mikroelektrod zgodnie z opisem w tekście towarzyszącym. Po wypalaniu mikrokuźnią średnica zewnętrzna czubka mikroelektrody powinna wynosić około 1 µm. Końcowa grubość ścianki pipety wynosi około 1/3 µm po znieczuleniu i dekapitacji trzytygodniowego szczura.

Rozpocząć sekcję od usunięcia skóry, przeprowadzenia sekcji głowy i usunięcia mózgu. Aby odsłonić kość skroniową, należy usunąć obie kości skroniowe. Umieścić każdą kość skroniową w czystym naczyniu sekcyjnym zawierającym standardowy roztwór pozakomórkowy. Kolejnym krokiem jest usunięcie fragmentu kości otaczającego kość skroniową, aby odsłonić ślimaka.

Mocno przytrzymaj kość skroniową u podstawy za pomocą pęsety. Zidentyfikuj okno okrągłe, okno owalne oraz ślimaka. Ustaw ślimaka tak, aby okno owalne i strona spiralna ślimaka były skierowane do góry.

Usuń nadmiar kości wokół ślimaka. Używając drugiej pary precyzyjnych pęset, odłup fragmenty kości bezpośrednio ze ślimaka, zaczynając od obszaru, który jest bardziej przezroczysty niż pozostała część kości. W tym miejscu kość jest cieńsza i łatwiejsza do usunięcia.

Kontynuuj usuwanie kości z okolic cewki szczytowej. Użyj mikroszczypców do rozcięcia modiolusa pod zakrętem szczytowym. Następnie oddziel zakręt szczytowy od niższych zakrętów ślimaka.

Należy zadbać o ochronę cewki wierzchołkowej. Nie wolno jej ciągnąć ani rozciągać. Na koniec należy usunąć zwoje wierzchołkowe z małżatrętki, unikając nadmiernego rozdarcia tkanki.

Użyj precyzyjnej pęsety, aby usunąć pozostałą część kości. Kolejnym krokiem jest usunięcie STR oculis oraz błony tialnej. Ostrożnie usuń STR oculis, czyli błyszczący pas tkanki znajdujący się na zewnątrz obszaru komórek rzęskowych.

Należy uważać, aby nie usunąć komórek rzęsek sensorycznych, które mogą łatwo oddzielić się wraz z STR oculis. Następnie, za pomocą precyzyjnej pęsety, oddziel błonę tialną. Jest to błyszcząca, półprzezroczysta błona znajdująca się nad komórkami rzęsek sensorycznych; teraz należy odciąć nadmiar tkanki i kości oraz rozpłaszczyć preparat pęsetą.

Jest to konieczne, aby tkankę można było równomiernie umieścić pod szpilką. Disekcja jest teraz zakończona. Umieść preparat pod szpilką na przygotowanym szkiełku nakrywkowym, dbając o to, aby po zakończeniu disekcji szpilka znajdowała się z dala od komórek rzęsek.

Użyj pęsety, aby przenieść preparat do komory rejestracyjnej, utrzymując kroplę płynu zewnątrzkomórkowego na szkiełku nakrywkowym, na którym znajduje się tkanka ślimaka, a następnie niezwłocznie rozpocznij perfuzję roztworem zewnątrzkomórkowym. Aby zapewnić lepsze przeżycie preparatu, użyj obiektywu mikroskopu 10 x lub obiektywu DIC z imersją wodną 40 x. W celu zlokalizowania preparatu, ustaw go tak, aby elektrody rejestrujące mogły zbliżyć się do komórek rzęsnych wewnętrznych pod kątem prostym do ich ścian bocznych.

Jeśli widoczność regionu podstawnego wewnętrznych komórek rzęsatych jest ograniczona z powodu zwinięcia się preparatu, należy użyć elektrody rejestrującej, aby docisnąć zewnętrzną krawędź preparatu do szkiełka nakrywki, uważając, by nie uciskać samych wewnętrznych komórek rzęsatych. W tym preparacie górna elektroda przytrzymuje zewnętrzną krawędź preparatu, a dolna elektroda zaznacza miejsce położenia batonów doprowadzających.

Jako punkt odniesienia, kamera NC 70 Nuv Con wyświetla na monitorze powiększony obraz Forex, aby ocenić, czy tkanka w obszarze wewnętrznych komórek rzęsatych jest zdrowa. Zlokalizuj wiązki rzęsek jako punkt odniesienia, a następnie ustaw ostrość w dół, aby znaleźć jądra komórkowe. Przesuń ostrość dalej w dół, w stronę podstawy wewnętrznych komórek rzęsatych wraz z ich zakończeniami doprowadzającymi, a następnie wróć w górę, aż do osiągnięcia poziomu jąder komórkowych na monitorze.

Teraz zlokalizuj batony doprowadzające wokół podstawy komórek rzęsistych wewnętrznych. Batony mają kształt sferyczny lub elipsoidalny, ich średnica wynosi około one micron i są jasne z błyszczącym wyglądem. Znajdziesz je, regulując ostrość w górę i w dół.

Kolejnym krokiem jest udrożnienie dostępu do włókien doprowadzających przy użyciu elektrody rejestrującej z końcówką o średnicy 1 µm wypełnioną roztworem wewnątrzkomórkowym. Przyłóż dodatnie ciśnienie i za pomocą mikromanipulatora wprowadź elektrodę do preparatu. Użyj tej elektrody, aby wykonać nacięcie w preparacie na poziomie podstawy wewnętrznej komórki rzęsistej.

Wsuń elektrodę pomiędzy cienką warstwę komórek podporowych a wewnętrzne komórki słuchowe, wykorzystując nadciśnienie, aby utworzyć drogę dostępu do obszaru u podstawy wewnętrznych komórek słuchowych. Ostrożnie wyjmij elektrodę i zastąp ją nową elektrodą o średnicy końcówki jednej mikrona, wypełnioną roztworem wewnątrzkomórkowym. Wykorzystując nadciśnienie w celu utrzymania czystości końcówki elektrody, przesuń elektrodę rejestrującą przez otwór dostępu, omijając sąsiednie komórki podporowe, w kierunku batonu aferentnego.

Upewnij się, że końcówka elektrody znajduje się bezpośrednio przed włóknem doprowadzającym; włókna stawiają większy opór podczas ruchu pipety niż komórki podporowe i błona wewnętrznych komórek słuchowych. Różnicę tę można wyczuć podczas przesuwania pipety; przesuwaj pipetę w górę i w dół oraz naciskaj, aby upewnić się, że włókno się porusza. Świadczy to o tym, że końcówka pipety i włókno znajdują się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania, a elektroda jest dociśnięta do włókna doprowadzającego. Jednocześnie zwolnij nadciśnienie i zastosuj podciśnienie, aby utworzyć uszczelnienie gigaomowe.

Zastosuj delikatne impulsy ssania, aby przerwać membranę wewnątrz elektrody i uzyskać rejestrację w konfiguracji whole-cell. Jeśli zapatchowana komórka jest aferentnym batonem, w trybie rejestracji whole-cell obserwuje się niewielkie przejściowe prądy pojemnościowe. Na tej rycinie przedstawiono typowy prąd przejściowy zarejestrowany z włókna aferentnego.

Rozpocznij rejestrację aktywności synaptycznej. Jeśli włókno doprowadzające nie wykazuje aktywności spontanicznej, zdepolaryzuj komórkę rzęskową, stosując roztwór zewnątrzkomórkowy o wyższym stężeniu potasu. Na tym rysunku przedstawiono typowe zależności prądowo-napięciowe dla włókien AFF po lewej stronie oraz dla wewnętrznych komórek rzęskowych po prawej stronie.

Zależności prądowo-napięciowe zarejestrowano przy potencjale trzymania wynoszącym -84 mV, stosując skoki napięcia od -124 mV do +36 mV w przyrostach co 10 mV. Napięcia są przedstawione po prawej stronie niektórych przebiegów, koncentrując się na zależnościach prądowo-napięciowych z włókna aferentnego. Zauważalna jest obecność pobudzeniowych prądów postsynaptycznych lub EPCs podczas większości skoków napięcia.

EPC przeszły przez zero przy wartości około +6 mV. Rejestrację przeprowadzono w obecności tetrodotoksyny w celu zablokowania prądów sodowych zależnych od napięcia. Bez blokera w rejestracji pojawiłyby się dodatkowo szybko aktywowane wewnątrzkomórkowe prądy sodowe, co pozwoliłoby zidentyfikować zapis jako rejestrację z włókna doprowadzającego. Należy zwrócić uwagę na wolno aktywowany prąd wewnątrzkomórkowy przy napięciach hiperpolaryzacyjnych.

Prąd ten nie występuje w wewnętrznych komórkach rzęsnych ani w komórkach podporowych, co stanowi dobrą wskazówkę, że rejestracja pochodzi z włókna doprowadzającego. Te zapisy przedstawiają zależności prądowo-napięciowe dla wewnętrznej komórki rzęsnej. Strzałka wskazuje szybko aktywowane zewnętrzne prądy potasowe przy potencjałach dodatnich.

Następnie występują opóźnione prądy potasowe prostownicze, wynikające z małej średnicy pipety i wysokiej rezystancji dostępu. Przedstawione tutaj prądy komórek rzęsek wewnętrznych są mniejsze niż wymagane do uzyskania dokładnych zapisów prądów komórek rzęsek wewnętrznych. Należy stosować pipety o niższej rezystancji dostępu.

Przedstawione tutaj rejestracje wykazują jednak, że relacje prądowo-napięciowe komórek włosych wewnętrznych i włókien doprowadzających można wyraźnie rozróżnić. Na tej rysunku przedstawiono prądy synaptyczne zarejestrowane z włókna doprowadzającego. Należy zwrócić uwagę na zmienną wielkość i kształt EPC.

Rejestracje przeprowadzono w temperaturze pokojowej, stosując tetrodotoksynę w celu zablokowania napięciowo zależnych prądów sodowych. Na rysunku przedstawiono jednoczesne rejestracje z komórki włókienek wewnętrznych oraz kontaktującego się z nią batonu aferentnego. W celu depolaryzacji komórki włókienek wewnętrznych zastosowano skok napięcia, w odpowiedzi na który zarejestrowano w niej prądy wapniowe do wewnątrz; napływ jonów wapnia do komórki włókienek wewnętrznych skutkuje uwalnianiem neuroprzekaźnika i aktywacją EPC w batonie aferentnym.

Należy zwrócić uwagę na depresję synaptyczną występującą podczas 50 milisekundowej depolaryzacji komórek rzęsnych wewnętrznych. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby zachować ostrożność podczas wycinania i przygotowywania tkanki ślimaka oraz wykazać się cierpliwością i optymizmem podczas prób rejestracji z zakończeń aferentnych.