Wysokoprzepustowy screening aktywności celulazy w procesie biominingu z bibliotek metagenomicznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja klonów wykazujących ekspresję celulazy z biblioteki metagenomicznej. Osiąga się to poprzez replikację wcześniej przygotowanej biblioteki metagenomicznej przy użyciu robota, po inkubacji zreplikowanej biblioteki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Następnie mierzy się wzrost klonów E. coli, a do zreplikowanej biblioteki dodaje się lizat, bufor oraz substrat.

Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące aktywność celulazy poprzez kolorymetryczne pomiary absorbancji z wykorzystaniem czytnika płytek. Cześć, jestem Keith z laboratorium Stevena Hallama w Katedrze Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wysokoprzepustowego screeningu funkcjonalnego bibliotek metagenomicznych.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania aktywności celulaz biomin z bibliotek metagenomicznych. Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem tego protokołu należy przygotować bibliotekę metagenomiczną przechowywaną w formacie płytki 384-dołkowej.

W badaniu tym wykorzystano wektor SMID PCC one copy control w połączeniu z komórkami e coli Farge T one resistant TRANSFECT max EPI 300 T one resistant jako gospodarza biblioteki; aby rozpocząć tę procedurę, należy wyjąć płytki zawierające bibliotekę z temperatury -80 °C i rozmrozić je w temperaturze 37 °C przez około 20 minut. W międzyczasie należy użyć funkcji sterylizacji światłem UV w urządzeniu QIX two, aby sterylizować robota przez 15 minut. Następnie należy przygotować urządzenie Q fill three zgodnie z instrukcją producenta, podłączając butelkę z pożywką do rozdzielacza za pomocą sterylnego przewodu.

Napełnij Q fill three odpowiednią ilością pożywki i ustaw urządzenie na dozowanie objętości 45 µL. W każdym dołku usuń powietrze z przewodów i rozdzielacza, korzystając z funkcji purge robota, aż pojawi się pożywka. Przy każdym pinie rozdzielacza napełnij żądaną liczbę płytek pożywką LB, używając Q fill three.

Napełnienie każdej płytki zajmuje około 20 sekund. Następnie należy umieścić płytki z biblioteką oraz nowe płytki w odpowiednich sekcjach urządzenia Q picks. Następnie należy zaprogramować robota, aby napełnił kąpiele czyszczące odpowiednimi odczynnikami.

2% micro 90 w tylnej kąpieli, autoklawowana woda destylowana w środkowej kąpieli oraz 80% etanol w przedniej kąpieli. Korzystając z programu replikacji urządzenia qix two, należy wybrać odpowiednią głowicę oraz liczbę i typy płytek źródłowych i docelowych. Należy również skonfigurować głowicę tak, aby była czyszczona pomiędzy replikacjami.

Zazwyczaj wystarczające jest przeprowadzenie sześciu cykli w każdej kąpieli. Pojemność urządzenia wynosi 10 płytek jednocześnie. Uruchom urządzenie.

Replikacja zajmie około 15 minut. Wykorzystano pełną pojemność głowicy 384-pinowej. Po zreplikowaniu płytek należy inkubować je w temperaturze 37 °C przez 24 godziny w komorze wilgotnościowej.

Długi czas inkubacji jest konieczny, ponieważ dodanie arabinozy indukuje wysoką liczbę kopii smid. W tym czasie należy wyczyścić robota Q fill three zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Po inkubacji wyjmij płytki z inkubatora ustawionego na 37 °C.

Odłóż pokrywki i umieść płytki na platformie załadunkowej magazynka dostarczonej wraz z szybkim stosownikiem. Pamiętaj o zachowaniu kolejności płytek, ponieważ oprogramowanie jej nie monitoruje. Odczytane zostaną płytki znajdujące się na spodzie stosu.

Najpierw wyjmij jeden magazynek z szybkiego stosu (rapid stack). Upewnij się, że jest on pusty, a następnie przesuń go na stos płytek przeznaczonych do odczytu. Chwyć magazynek za uchwyt, aby płytka załadowała się do wnętrza magazynka.

Włóż magazyn do szybki stackera w odpowiedniej orientacji. Uruchom program do skanowania na podłączonym komputerze. Wybierz nową sesję i nadaj jej odpowiednią nazwę.

Wybierz płytkę 384-dołkową z płaskim dnem jako płytkę eksperymentalną. Wpisz dane w obszarze układu płytki. Kliknij przycisk kreatora i wybierz go, aby dodać do płytki 384 próbki nieznane.

W obszarze protokołu wybierz opcję pętli studzienek (well loop) i wprowadź wartość dla 384 studzienek. Po lewej stronie ekranu, w drzewie przepływu, pojawi się ikona pętli studzienek. Wybierz tę ikonę i kliknij, aby dodać pomiar fotometryczny.

Ustaw odczyt na 600 nanometrów. Zapisz protokół pod unikalną nazwą i zamknij program do skanowania. Następnie otwórz program Polara RS.

Na stronie głównej znajduje się tabela z listą instrumentów podłączonych do urządzenia rapid stack; w nagłówku VARI scan należy kliknąć opcję run session. Następnie powinno pojawić się okno analizy z schematem blokowym w centralnej części. Wybierz pozycję run session, a następnie odszukaj nazwę zapisanego skanowania.

Należy ponownie uruchomić procedurę w menu rozwijanym, które pojawi się po prawej stronie ekranu. Po wybraniu protokołu należy kliknąć run. W przypadku tego testu pojawi się okno z zapytaniem, który magazynek należy wykorzystać jako źródło, a który magazynek jest pusty.

Dolne pole na ekranie odpowiada przedniemu magazynowi kaset. Upewnij się, że zarówno moduł rapid stack, jak i Vario scan są włączone, a następnie kliknij start. Moduł rapid stack automatycznie załaduje płytki do czytnika płytek, umożliwiając ciągłe pomiary płytek.

Obserwuj ładowanie pierwszej płyty do skanera Vario, aby upewnić się, że urządzenia są odpowiednio wyrównane do odczytu. Przeskanowanie 25 płyt zajmuje około 50 minut. Po zakończeniu skanowania Vario wyjmij pełny magazynek i umieść go na platformie ładowania magazynków.

Podnieś zewnętrzny prostokąt platformy, a magazyn powinien zsunąć się, pozostawiając płytki ułożone w stosie w środku. Na koniec, w przypadku przesiewu opartego na roztworach, załóż pokrywki na płytki. Aby najpierw sprawdzić aktywność celulazy, przygotuj mieszaninę do analizy, używając gotowego 10-krotnego stężenia zapasu lizy.

Wymieszać w 50 milimolarnym buforze octanu potasu o pH 5.5 zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Następnie przygotować roztwór zapasowy chromogennego substratu biocydynego dla komórek DIPHENYL lub DNP o stężeniu do 75 miligramów na mililitr w DMSO, upewniając się, że substrat został całkowicie rozpuszczony. Dodać roztwór zapasowy biocydu komórkowego DNP do mieszaniny testowej do końcowego stężenia 0,1 miligrama na mililitr.

Należy pamiętać, że każda płytka zużywa około 20 ml roztworu, a dodatkowe 50 ml jest niezbędne, aby uwzględnić objętość martwą. Skonfiguruj Q fill three jak poprzednio, aby dozować mieszaninę testową do każdej płytki za pomocą Q fill three. Napełnienie każdej płytki zajmuje około 20 sekund.

Po dodaniu mieszaniny assay, inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 12 do 16 godzin. Korzystając z komory wilgotnościowej, wyjąć płytki z inkubatora ustawionego na 37 °C. Zdjąć pokrywki i umieścić płytki na platformie załadunkowej magazynu dostarczonej z systemem rapid stack w ten sam sposób, co poprzednio.

Otwórz program skanera i skonfiguruj go w taki sam sposób jak poprzednio, z wyjątkiem pomiaru fotometrycznego, który należy ustawić na odczyt przy 400 nanometrach. Następnie wprowadź parametry do programu POLARA RS, tak jak zostało to wcześniej zademonstrowane.

Pozwól urządzeniu Vario scan na odczyt płytek. Po zakończeniu procesu wyjmij i zutylizuj płytki. Aby wyeksportować odczyty absorbancji, otwórz oprogramowanie scan it re i wybierz.

Otwórz istniejący plik. Wybierz katalog, w którym zapisano sesję, i kliknij ikonę plusa, aby rozwinąć listę. Pod nagłówkiem tytułu znajdą się opcje oznaczone od container one do container N. W zależności od liczby płytek, wybierz w pasku menu na górze strony pierwszą płytkę do analizy, a następnie wybierz data report export.

Wybierz opcje eksportu, takie jak układ płytki i dane fotometryczne. Kliknij „view report”, a następnie „file save”. Wybierz żądany katalog.

Format wyjściowy to arkusz kalkulacyjny Microsoft Excel. Przedstawiono tutaj odczyty absorbancji z jednej płytki 384-dołkowej zawierającej klona pozytywnego; klony pozytywne wykazują wyraźny wzrost absorbancji w porównaniu do klonów niewykazujących aktywności celulazy.

Różnice w czasie trwania analizy, numerze studzienki, jej położeniu na płytce lub stężeniu DNP mogą wpływać na bezwzględne odczyty absorbancji. Relatywne odczyty absorbancji, takie jak różnica w absorbancji względem średniej dla całej płytki lub średniej dla danej kolumny, stanowią bardziej wiarygodną metodę identyfikacji klonów wykazujących aktywność celulazy. Właśnie pokazaliśmy, jak zidentyfikować klony pozytywne pod kątem produkcji celulazy z biblioteki metagenomicznej.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o rozpuszczeniu bio-strony komórek DNP w DMSO oraz o inkubacji płytek w komorze wilgotnościowej. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.