Wykorzystanie reaktorów przepływowych kropelkowych oraz reaktorów z obracającym się dyskiem do analizy biofilmu Staphylococcus aureus

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla biofilmów bakteryjnych przy niskim lub umiarkowanym naprężeniu ścinającym z wykorzystaniem reaktora biofilmowego z przepływem kropelkowym lub reaktora z obracającym się dyskiem. Kupony w reaktorach biofilmowych są najpierw inokulowane bakteriami i inkubowane w temperaturze 37°C, aby umożliwić przywieranie komórek bakteryjnych do powierzchni wzrostu. Po przytwierdzeniu się komórek do kuponów uruchamia się przepływ pożywki, wytwarzając naprężenie ścinające, które oddziałuje podczas rozwoju biofilmu.

Dojrzałe biofilmy można następnie zebrać w celu przeprowadzenia analizy i obserwacji. W celu określenia ultrastruktury powstałych biofilmów można zastosować skaningową mikroskopię elektronową. Jestem Blaze Balls.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak komory przepływowe, jest łatwość uzyskania wysokiej produkcji biomasy oraz wielu identycznych biofilmów. Procedurę tę zaprezentują Rachel Stevenson i Kelly Schwartz, technik oraz doktorantka z mojego laboratorium. Reaktor biofilmu z przepływem kropelkowym składa się z czterech komór z portami wlotowymi dla pożywki oraz portami wylotowymi dla odpadów.

Wewnątrz każdej komory znajduje się wyjmowany kupon, na którym narasta biofilm. Aby zmontować reaktor biofilmu z przepływem kropelkowym, umieść kupony w każdej równoległej komorze i zabezpiecz pokrywy komór. Zautoklawuj zmontowany reaktor oraz rurki doprowadzające pożywkę, aby wysterylizować system przed użyciem.

Należy również wysterylizować w autoklawie pożywkę do wzrostu biofilmu w celu zaszczepienia wysterylizowanego reaktora przepływowego typu kropelkowego. Aparaturę należy ustawić na płaskiej powierzchni i zacisnąć linie odpływowe. Następnie każdą komorę należy wypełnić 10 ml sterylnej pożywki wzrostowej na bazie triptych soy broth i dodać 100 µl staphylococcus aureus.

Kulturę nocną wyhodowano w tym samym medium osobno dla każdej komory. Zaszczepiony reaktor umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 18 godzin, aby umożliwić adhezję komórek do powierzchni kuponu. Po inkubacji odpięto zacisk z rurki odpływowej i umieszczono reaktor na drewnianym bloku pod kątem 10 stopni. Wszystkie czynności wykonano aseptycznie.

Podłącz rurkę z pożywką do butelki zawierającej pożywkę w przepływie ciągłym. Przeciągnij linię rurek przez pompę i odpowietrz je, uruchamiając pompę z pełną prędkością. Po odpowietrzeniu rurek zatrzymaj pompę i przymocuj igły o rozmiarze 22 G i długości jednej cala do końców każdej z rurek.

Przetrzyj korek wlotowy komory chusteczką nasączoną etanolem w sposób aseptyczny. Wprowadź igły przez korek wlotowy. Włącz pompę i pozwól, aby pożywka okapywała próbki.

Przy szybkości przepływu wynoszącej około 125 µL/min, medium powinno przepływać w dół z otworu wlotowego do otworu odpływowego. Reaktor należy prowadzić w trybie przepływu ciągłego przez trzy dni, okresowo sprawdzając, czy odpływ z reaktora przebiega prawidłowo.

Drenaż jest kontrolowany poprzez inspekcję wizualną komór w celu upewnienia się, że pożywka nie gromadzi się w ich wnętrzu. Jeśli pożywka się gromadzi, zaciśnięcie rurek odpływowych zazwyczaj ułatwi prawidłowy drenaż w celu zbioru biofilmów; w takim przypadku należy zatrzymać pompę i usunąć igły z reaktora. Następnie należy ustawić reaktor na płaskiej powierzchni.

Po trzech dniach ciągłego przepływu biofilmy Staphylococcus aureus pojawiają się w postaci żółtej biomasy rozprzestrzenionej wzdłuż długości zaszczepionych kuponów. Skaningowa mikrografia elektronowa biofilmu ujawnia Staphylococcus aureus pokrywający kupon w formie wspólnoty biofilmu związanej z powierzchnią. Aby określić ilość uzyskanej biomasy, należy za pomocą sterylnej pęsety aseptycznie usunąć kupony, zebrać bakterie za pomocą skrobaka do komórek, a następnie przenieść je do probówki stożkowej zawierającej 5 mL sterylnego PBS.

Używając homogenizatora tkankowego, rozbij grudki bakteryjne aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Jednostki tworzące kolonie są oznaczane ilościowo poprzez wysiew rozcieńczeń szeregowych na płytki z agarem tryptonowym, inkubację przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i przeliczanie kolonii. Reaktor biofilmu z obrotowym dyskiem składa się z chemostatu, przez który pompowana jest pożywka wzrostowa.

Wirująca tarcza z prętem w kształcie gwiazdy oraz 18 kuponów zaprojektowanych tak, aby pasowały do tarczy. Aby złożyć reaktor, należy najpierw umieścić kupony w szczelinach wirującej tarczy. Następnie załadowaną tarczę należy umieścić w jednolitrowym zlewce szklanym z otworem przelewowym i zamknąć reaktor gumowym korkiem nr 15 z jednym otworem do przepływu pożywki oraz jednym otworem do napowietrzania.

Zautoklawuj zmontowany reaktor wraz z przewodami doprowadzającymi, aby wysterylizować układ. W celu zaszczepienia reaktora, napełnij zlewkę 250 milliliters sterylnej pożywki hodowlanej i dodaj 500 microliters nocnej kultury staphylococcus aureus wyhodowanej w bulionie sojowym triptych. Umieść reaktor na mieszadle magnetycznym ustawionym na 250 rotations per minute i inkubuj go przez noc w temperaturze 37 degrees Celsius, aby umożliwić adhezję komórek do kuponów.

Po inkubacji nocnej podłączyć rurkę wlotową do otworu w zbiorniku z pożywką oraz do pompy perystaltycznej. Włączyć pompę i ustawić przepływ na 0,25 milliliters per minute. Pozostawić reaktor w działaniu przez 24 godziny w temperaturze 37 degrees Celsius w celu zebrania powstałych biofilmów.

Zatrzymaj reaktor i w warunkach aseptycznych wyjmij dysk, nie dotykając kuponów. Za pomocą sterylnej pęsety wyjmij kupony i ostrożnie zanurz każdy z nich w sterylnym PBS, aby usunąć luźno przytwierdzone bakterie przed testowaniem związków przeciwdrobnoustrojowych.

W warunkach aseptycznych umieść kupony w poszczególnych dołkach płytki 96-dołkowej zawierającej badane związki. Inkubuj płytkę przez cztery godziny w temperaturze 37 °C. Następnie przenieś kupony do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierających 1× PBS i rozbij biofilmy za pomocą homogenizatora.

Na koniec należy wysiać rozcieńczenia seryjne komórek na pożywkę agarową w celu oznaczenia liczby żywych jednostek tworzących kolonie w próbce, zgodnie z wcześniejszym opisem. Wykres ten przedstawia liczbę jednostek tworzących kolonie w biofilmach przygotowanych przy użyciu reaktora z wirującym dyskiem i wystawionych na działanie nadtlenku wodoru, co potwierdza możliwość wytworzenia do 18 identycznych biofilmów. Zastosowanie reaktora z wirującym dyskiem sprawia, że technika ta jest idealna do testowania związków przeciwdrobnoustrojowych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat prowadzenia biofilmów w reaktorach z przepływem kroplowym oraz w reaktorach z obracającym się dyskiem. Reaktory te stanowią alternatywę dla biofilmów w komorach przepływowych i na płytkach mikrotitracyjnych i są idealne w sytuacjach, gdy wymagana jest duża ilość biomasy biofilmu lub gdy planowane jest testowanie środków przeciwdrobnoustrojowych na uformowanych biofilmach.