Podskórna infekcja groncem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest zbadanie przeżywalności i rozprzestrzeniania się gronkowca złocistego opornego na metycylinę (MRSA) oraz poziomów chemokin i cytokin w miejscach infekcji. Cel ten osiąga się poprzez usunięcie futra z grzbietów myszy, aby uzyskać wyraźny obszar obserwacji. Jako drugi krok.

Suspensję MRSA należy podać myszom podskórnie trzy dni po zakażeniu; patologie infekcyjne oraz liczbę bakterii można ocenić, wyznaczając liczbę jednostek tworzących kolonie z homogenizatów tkanek na płytkach z agarem. Witaj, jak się miewasz? Nazywam się De Lordon.

Jestem pracownikiem naukowym po doktoracie. Cześć, nazywam się Mariel Sanchez. Jestem doktorantką, a ja jestem Andrea Huda.

Jestem pracownikiem naukowym w laboratorium George'a Lee w oddziale pediatrycznym Cedar-Sinai Medical Center. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny, takie jak modelowanie ciężkich infekcji, w tym zapalenia mięśni, zapalenia wielomięśniowego oraz martwiczej zapalenia powięzi. Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w ciężkie infekcje nagłe, można ją zastosować również w innych układach, takich jak paciorkowce grupy A oraz inne organizmy.

Dodatkowo możemy badać funkcję i patogenezę innych organizmów wywołujących zapalenie mięśni oraz zapalenie wielomi性śniowe. Zazwyczaj osoby rozpoczynające tę procedurę mogą napotkać trudności, ponieważ jeden z regulatorów globalnych obszarów caucus jest wysoce zmienny. Jeśli nie zachowa się ostrożności, zebrane dane mogą wykazywać znaczną zmienność, co utrudni ich późniejszą interpretację.

Zacznijmy. W laboratorium poziomu BSL 2 przygotuj płytkę z agarem z krwią owczą na bazie TSA oraz sterylną pętlę, wykorzystując blok mrożący. Wyjmij kulturę zakładową Mercer z przechowywania w temperaturze -80 °C.

Następnie za pomocą sterylnej pętli przenieś niewielki odłamek lodu z kultury macierzystej na płytkę. Po pobraniu małego fragmentu kultury macierzystej Mercer natychmiast przenieś ją z powrotem do zamrażarki, aby zapobiec rozmrożeniu, ponieważ wielokrotne zamrażanie i odmrażanie uszkodzi kulturę macierzystą. Użyj pętli do posiewu na agarze w celu umożliwienia wzrostu pojedynczych kolonii Mercer.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez noc, bez dodatku CO2. Następnego dnia przygotuj i opisz nową płytkę z agarem krwi owczej, płytkę TSA oraz probówkę z zakrętką typu snap o pojemności 15 ml zawierającą 3 ml THB.

Wyjmij płytkę M SSA po inkubacji nocnej i oceń fenotyp hemolityczny kolonii. Za pomocą sterylnej pętli wybierz kolonię o fenotypie zgodnym z koloniami z poprzednich doświadczeń. Zaszczep bulion THB wybraną kolonią, stosując tę samą technikę posiewu pętlą.

Inkubuj płytkę z roztworem THB w temperaturze 37°C przez noc, wstrząsając z prędkością 220 obr./min. Bakterie te zostaną wykorzystane do zaszczepienia kultury w celu wywołania infekcji podskórnej u myszy w późniejszych etapach. Umieść płytkę z agarem krwi również w inkubatorze.

Płytki zostaną wykorzystane następnego dnia rano w celu potwierdzenia, czy fenotyp hemolityczny bakterii w roztworze THB jest zgodny z fenotypem pierwotnie wybranej kolonii. Jeśli fenotyp hemolizy nie jest zgodny z pierwotnym klonem, nie należy rozpoczynać eksperymentu. Przenieś mysz na platformę i ogol futro na jej grzbiecie.

Jeśli zwierzę jest nadmiernie agresywne, konieczna może być sedacja izofluranem. Nanieś około pięciu milimetrów sześciennych kremu do usuwania włosów, takiego jak NA, na ogoloną okolicę. Preparat NA można nabyć w lokalnej aptece.

Należy upewnić się, że zakupiony krem do depilacji zawiera olej dla dzieci, ponieważ produkt bez tego dodatku będzie zbyt drażniący dla myszy. Pozostaw krem na powierzchni skóry na około jedną minutę; w czasie inkubacji kremu do depilacji zwilż kilka ręczników papierowych wodą dwukrotnie destylowaną. Po minucie użyj mokrych ręczników papierowych, aby dokładnie oczyścić zgoloną okolicę.

Upewnij się, że skóra jest oczyszczona z kremu do depilacji. Podgrzej wstępnie 10 mL THB w probówce o pojemności 50 mL z nakrętką w temperaturze 37 °C w inkubatorze bakteryjnym przez okres od 4 do 10 godzin. Przenieś 20 µL nocnej hodowli bakterii do podgrzanego THB. Pozwoli to na rozcieńczenie nocnej hodowli.

Zawiesina w rozcieńczeniu 1:500. Umieścić probówkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze wytrząsającym przy 220 obr./min przez około dwie i pół do trzech godzin. Po okresie inkubacji użyć większej ilości THB, aby dodatkowo rozcieńczyć zawiesinę bakteryjną do 1:10, a następnie zmierzyć zawiesinę spektrofotometrem.

Przy absorbancji 514 nanometrów. Należy kontynuować inkubację zawiesiny w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 220 obr./min, aż rozcieńczona dziesięciokrotnie zawiesina osiągnie wartość 0,25. Aby zebrać materiał, należy odwirować probówkę o pojemności 50 ml z prędkością 3 225 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić nadosad i resuspender osad.

Osad bakteryjny zawiesić w 10 mililitrach DPBS i ponownie wyprać bakterie, powtarzając etap wirowania dla tego modelu ciężkiej infekcji. Osad bakteryjny ponownie zawiesić w około jednym mililitrze DPBS, aby uzyskać stężenie około 1 × 10¹⁰ jednostek tworzących kolonie na mililitr. Przygotować płytki A-R-T-S-A z krwią owczą, a następnie przeprowadzić seryjne rozcieńczenia bakterii od 10¹ do 10⁸ w DPBS i wysiać na płytki.

Nanieś krople po 10 µL seryjnie rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej na płytkę z agarem krwi w trzech powtórzeniach. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez noc. Po inkubacji płytek przez 16 do 18 godzin zaobserwuj i zapisz fenotyp hemolizy szczepu.

Policz jednostki tworzące kolonie na płytkach. Inokulum infekcyjne zostanie obliczone na podstawie liczby jednostek tworzących kolonie na płytkach.

Przygotować strzykawkę zawierającą 100 µL zawiesiny bakteryjnej w DPBS przygotowanej wcześniej. Przed iniekcją myszy należy poddać sedacji, tak aby częstotliwość ich oddechów wynosiła około jednego na sekundę. Na potrzeby demonstracji w tym filmie pokazano mysz poddaną eutanazji.

Po wykonaniu iniekcji wstrzyknij M ser w jeden bok ciała. Przenieś mysz z powrotem do klatki. Obserwuj zwierzęta przez trzy do pięciu godzin po iniekcji, aby upewnić się, że mysz żyje przed przeniesieniem jej z powrotem do pomieszczenia dla zwierząt.

Codziennie monitoruj zmiany na grzbietach zwierząt po ich uśpieniu. Zmierz i odnotuj wielkość oraz stan zmian skórnych. Powierzchnię zmian skórnych i mięśniowych wyznacza się poprzez pomnożenie długości i szerokości zmiany w milimetrach.

Zmiany o nieregularnym kształcie należy podzielić na mniejsze, symetryczne fragmenty, a każdy z nich zmierzyć tą samą metodą. Przygotować probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierające 100 µl DPBS do pobierania tkanek. Naciąć skórę sterylnym ostrzem żyletki i wyciąć zmianę za pomocą sterylnych nożyczek.

Podczas wycinania zmiany należy upewnić się, że wycięto również około dwóch do pięciu milimetrów zdrowej skóry otaczającej ten obszar. Umieść zmianę w probówkach do pobierania tkanek w celu analizy zmian mięśniowych. Ostrożnie zdejmij skórę, aby zmierzyć rozmiar i zapisać stan zmiany w tkance mięśniowej.

Pobierz śledzionę i nerki. Umieść te tkanki w osobnych probówkach do pobierania. Zhomogenizuj tkanki, mieszając je za pomocą strzykawki o pojemności one milliliter przez około 30 seconds.

Do każdej probówki dodać 900 µL DPBS. Przygotować płytki THA i homogenizować próbki tkanek w wstrząsarzu wortex przez pięć minut. Wykonać rozcieńczenia seryjne próbki.

Przygotuj zawiesiny w rozcieńczeniach od 1 do 10⁶. Na płytki 96-dołkowe nanieś po 10 µL każdej seryjnie rozcieńczonej zawiesiny. Inkubuj płytki przez noc w inkubatorze bakteryjnym w temperaturze 37 °C.

Następnego ranka należy policzyć jednostki tworzące kolonie na płytkach i obliczyć ich liczbę na podstawie czynników rozcieńczenia. Jeśli zakażenie zostało przeprowadzone prawidłowo, bezpośrednio po wstrzyknięciu podskórnym na powierzchni skóry pojawi się pęcherzyk. Brak pęcherzyka może oznaczać, że wstrzyknięcie było zbyt głębokie, co może wpłynąć na wynik zakażenia.

Wielkość zmian oraz przeżywalność bakterii można oceniać w różnych punktach czasowych po zakażeniu MSA. Poniższe zmiany skórne zostały zbadane w trzeciej dobie po zakażeniu i stanowią przykłady zmian u myszy CD-1 zainfekowanej na jednym boku dawką 1 × 10⁷ jednostek tworzących kolonie. Zmiany mięśniowe znajdują się zazwyczaj w tkankach poniżej zmian skórnych.

Poniżej przedstawiono przykłady odpowiadających im zmian na powierzchni mięśni dla wcześniej pokazanych zdjęć zmian skórnych. Są to zmiany w obrębie mięśni zaobserwowane w trzeciej dobie po zakażeniu myszy dawką 1 × 10⁷ jednostek tworzących kolonie. Powierzchnię zmiany określa się jako iloczyn długości i szerokości zmiany zmierzonej w milimetrach; parametr ten można wykorzystać do oceny uszkodzeń tkanki skóry.

Liczbę jednostek tworzących kolonie bakterii zlokalizowanych w miejscu zakażenia można określić ilościowo na wyciętych zmianach chorobowych. Liczba jednostek tworzących kolonie może wskazać, czy dany czynnik wirulencji zapewnia MSA przewagę w przeżywalności. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przestrzeganiu standardowych środków ostrożności ze względu na użycie igieł oraz wysoce patogennych drobnoustrojów.

Jako ostatni model ropnia stosujemy dawkę inokulum 1000 razy niższą w porównaniu do naszego modelu, co pozwala odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jakie czynniki S sprzyjają uporczywej infekcji RSA? Należy pamiętać, że praca ze strzykawkami wypełnionymi Mars A może być niezwykle niebezpieczna; niezbędne jest przestrzeganie środków ostrożności, takich jak bezpośrednie wyrzucanie strzykawki do pojemnika na odpady ostre, aby uniknąć przypadkowego zakłucia igłą. Ponadto w tym doświadczeniu ważne jest przestrzeganie standardowych protokołów BSO2, aby zapewnić właściwą dezynfekcję obszaru roboczego.

To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie. Cześć. Cześć, do widzenia.