Eksperyment profilu bioenergetycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest badanie statusu funkcjonalnego mitochondriów w żywych komórkach oraz w izolowanych mitochondriach poprzez pomiar wielu parametrów metabolizmu oksydacyjnego przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego XF 96. Parametrami tymi są oddychanie podstawowe, obrót ATP, przeciek protonowy oraz oddychanie maksymalne lub rezerwowa zdolność oddechowa. Jest to realizowane poprzez sekwencyjne dodawanie specyficznych modulatorów oddychania mitochondrialnego do komórek mioblastów C2C12 i pomiar zmiany tempa zużycia tlenu, czyli OCR, będącego wskaźnikiem oddychania, oraz konwersji glukozy do mleczanu, która generuje ATP w procesie glikolizy.

Drugim głównym szlakiem energetycznym w komórkach jest ECAR, czyli zewnątrzkomórkowy wskaźnik zakwaszenia. Można uzyskać wyniki profilowania mitochondriów, które dają wgląd w kluczową rolę, jaką funkcja mitochondriów odgrywa w określaniu długości życia komórek. Witam, nazywam się David Nichols.

Przez całą moją karierę zajmowałem się badaniami nad mitochondriami, a najważniejszym urządzeniem, którego używałem w moich studiach, była elektroda tlenowa. Jeśli potrafisz zmierzyć tempo poboru tlenu w różnych warunkach przy użyciu izolowanych mitochondriów, uzyskujesz ogromną ilość istotnych informacji. Jednak w przypadku przejścia do badania komórek, zwłaszcza tych hodowanych na płytkach wielodołkowych lub na szkiełkach nakrywkowych, klasyczne metody nie sprawdzają się.

Jest to poważny problem, który został rozwiązany kilka lat temu dzięki opracowaniu testu na płytkach wielodołkowych, umożliwiającego równoległe badanie oddychania komórek w formacie wielodołkowym. To, co zobaczą Państwo dzisiaj, to bardzo prosty, lecz bogaty w informacje eksperyment, który opracowaliśmy w celu monitorowania podstawowych funkcji bioenergetycznych mitochondriów w hodowlach komórkowych. Aby rozpocząć, należy wysiać komórki na płytki do hodowli komórek XF 96 w zagęszczeniu 10 000 komórek na dołek w 100 µL pożywki wzrostowej, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 10% CO2.

Komórki można poddać analizie w systemie XF 96 w 24 godziny po ich wysianiu przy użyciu testu. Kreator generuje szablon z następującym układem grup. Kolumny od 1 do 12 zawierają po 10 000 komórek C2C12.

Grupa pierwsza, zaznaczona na niebiesko, służy jako komórki kontrolne. Grupie drugiej, zaznaczonej na czerwono, zostaną podane leki oligomycyna, FCCP oraz roone. Następnie należy przygotować związki w medium do testów X-F-D-M-E-M zgodnie z opisem w pisemnej części protokołu.

Oligo Mycin, FCCP i rotenon. Związki te są wcześniej odmierzone w zestawie XF cell MIT stress test. Używając stacji XF prep, zastąp pożywkę wzrostową pożywką roboczą DMEM.

Na koniec inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C bez dwutlenku węgla przez 60 minut, aby komórki mogły wstępnie wyrównać potencjał z medium do analizy przed dodaniem związków wstrzykiwanych do kartridża czujnika; doprowadź związki do temperatury 37 °C. Następnie wprowadź je do portów wtryskowych w następujący sposób. Dla kolumn od pierwszej do czwartej wprowadź odpowiednio 16, 18 i 20 µL medium do analizy XF lub DMEM do portów A, B i C.

Dla kolumn od piątej do dwunastej należy nanieść 16 µL oligomycyny do portu A, 18 µL FCCP do portu B oraz 20 µL rotenonu do portu C. Następnie w ustawieniach protokołu należy ustawić liczbę powtórzeń pętli na trzy, czas mieszania na trzy minuty oraz czas pomiaru na trzy minuty. Na koniec należy kliknąć start.

Postępuj zgodnie z instrukcjami na ekranie, które poinformują użytkownika o momencie załadowania kartridża po zakończeniu kalibracji. Postępuj zgodnie z komunikatami użytkownika i dodaj płytkę z komórkami do eksperymentu. Następnie kliknij kontynuuj i pozwól na przeprowadzenie analizy.

Wyjmij płytkę po zakończeniu eksperymentu. Niniejszy test został opracowany na podstawie klasycznego eksperymentu służącego do profilowania funkcji mitochondriów i stanowi podstawę do budowy bardziej złożonych eksperymentów mających na celu zrozumienie wpływu różnych związków na metabolizm komórkowy, funkcje mitochondriów oraz ogólną aktywność bioenergetyczną. W tym przypadku zaobserwowano oczekiwaną odpowiedź w tempie zużycia tlenu po potraktowaniu komórek kolejno każdym z związków.

W przypadku ligamycyny poziom ATP spadł w wyniku zablokowania syntezy ATP w kompleksie V mitochondrium. Ponieważ po zastosowaniu ligamycyny komórki nie były w stanie syntetyzować ATP poprzez fosforylację oksydacyjną, powróciły do glikolizy, aby zaspokoić zapotrzebowanie na ATP. W związku z tym zaobserwowaliśmy wzrost ECAR (wskaźnika zakwaszenia zewnątrzkomórkowego), który, jak wykazano wcześniej, jest wskaźnikiem glikolizy. FCCP działa jako czynnik rozprzęgający i znosi ograniczenie powrotu protonów.

Oddychanie przyspiesza i jest teraz ograniczone przez transport elektronów. Na koniec rotenon hamuje kompleks I mitochondriów, co powoduje zatrzymanie przepływu elektronów w łańcuchu transportu elektronów, a w konsekwencji drastycznie zmniejsza zużycie tlenu. W ten sposób uzyskuje się informacje o oddychaniu podstawowym komórek, procencie zużycia tlenu przeznaczonym na produkcję ATP, a także o ilości przeznaczonej na utrzymanie gradientu protonowego wynikającego z wycieku protonów.

Ponadto możemy uzyskać maksymalną szybkość oddychania w warunkach oddychania rozsprzęganego, co czasem określa się mianem rezerwowej wydolności oddechowej. I wreszcie możemy określić ilość zużycia tlenu niezwiązaną z procesami mitochondrialnymi. Właśnie zaprezentowano to za pomocą urządzenia Seahorse.

XF 96 to seria eksperymentów dostarczających ogromnej ilości informacji na temat energetyki BIE mitochondriów w komórce. Podstawowy eksperyment, który jest kluczowy i określany jako eksperyment numer jeden, dostarcza informacji o oddychaniu podstawowym, obrocie ATP, przecieku protonów w mitochondriach oraz rezerwowej wydolności oddechowej. Parametry te dają fundamentalną wiedzę o stanie bioenergetycznym mitochondriów w komórce.