Kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej
20 października 2023
Izolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej mogą być używane do analizy funkcji i zaburzeń immunologicznych, chorób metabolicznych lub funkcji mitochondriów. W niniejszej pracy opisujemy znormalizowaną metodę przygotowania PBMC z krwi pełnej i późniejszej krioprezerwacji. Kriokonserwacja sprawia, że ten czas i miejsce są niezależne.
Za pomocą tej metody chcemy opisać procedurę, która jest odpowiednia do krioprezerwacji PBMC w taki sposób, aby po rozmrożeniu parametry bioenergetyczne pozostały niezmienione. Jednym z głównych wyzwań eksperymentalnych związanych z krioprezerwacją jest to, że proces zamrażania i rozmrażania może uszkodzić PBMC, co wpływa na następujące pomiary bioenergetyczne. W naszym protokole staramy się pokazać sposób na niezawodne zachowanie PBMC bez uszkodzenia komórek, tak aby nie miało to wpływu na mierzone parametry bioenergetyczne.
Możliwość zachowania PBMC pozwala na pobieranie próbek z różnych ośrodków i pomiary w jednym miejscu. Sprawia również, że pomiar jest bardziej niezależny od czasu. Kriokonserwacja PBMC pozwala na jednoczesne prowadzenie badań w wielu miejscach, w których komórki są zbierane i konserwowane.
Pobrane próbki mogą być następnie mierzone centralnie. Usprawnia to proces i planowanie badań. Na początek dodaj osiem mililitrów DPBS do sterylnej 50-mililitrowej stożkowej probówki.
Do tego dodaj osiem mililitrów krwi i użyj trzymililitrowej plastikowej pipety Pasteura, aby dobrze wymieszać zawartość. Dodaj 15 mililitrów pożywki do izolacji limfocytów do innej stożkowej probówki. Przechyl rurkę o 20 do 30 stopni.
Następnie za pomocą trzymililitrowej pipety Pasteura delikatnie nałożyć pierwszą warstwę mieszanki DPBS krwi na podłoże izolacyjne. Pozostałą mieszaninę ostrożnie ułóż na bocznej ściance tuby. Powoli ustaw probówkę w pozycji pionowej, aby nałożyć pozostałą krew na warstwę krwi.
Odwirować probówkę o sile 1 000 G przez 10 minut w temperaturze pokojowej w wahadłowym wiadrze przy wyłączonych hamulcach. Mieszanina krwi i PBMC rozdzieli się na cztery odrębne warstwy. Za pomocą pipety Pasteura usuń 2/3 warstwy osocza, a następnie użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby zebrać PBMC.
Przenieś PBMC do nowej 50-mililitrowej tuby, aż cała warstwa zostanie zebrana. Następnie uzupełnij objętość do 25 mililitrów za pomocą DPBS, aby usunąć resztki pożywki izolacyjnej i inne pozostałości. Odwirować probówkę o sile 100 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z włączonymi hamulcami.
Następnie usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej. Następnie ponownie zawieś granulat w jednomililitrowym DPBS i dodaj więcej DPBS, aby uzupełnić objętość do 25 mililitrów, aby umyć i ponownie zawiesić granulkę. Schłodzić pojemnik do zamrażania do czterech stopni Celsjusza.
Następnie umieść płodową surowicę bydlęcą na lodzie. Zawiesić osad komórkowy zawierający wyizolowane PBMC w jednym mililitrze płodowej surowicy bydlęcej. Następnie wymieszaj DMSO ze schłodzonym serum na lodzie w proporcji 1:5.
Przenieś zawiesinę komórek do dwumililitrowych oznakowanych probówek kriogenicznych, używając jednej probówki na probówkę zbiorczą. Dzięki automatycznemu licznikowi komórek określ liczbę komórek i żywotność. Użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby wrzucić jeden mililitr mieszaniny DMSO/FBS do probówki.
Następnie umieść probówki we wstępnie schłodzonym pojemniku do zamrażania. Umieść pojemnik w zamrażarce w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na 24 godziny. Następnego dnia wyjmij probówki z zamrażarki i przechowuj je w fazie gazowej ciekłego azotu.
Liczba komórek i żywotność były spójne przed i po krioprezerwacji, co wskazuje na udaną izolację i konserwację.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zestandaryzowaną metodę przygotowania i kriokonserwacji mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMCs). Protokół ma na celu zachowanie parametrów bioenergetycznych po rozmrożeniu, co zapewnia wiarygodność pomiarów w badaniach funkcji odpornościowej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Biologia komórki
- Bioenergetyka
Wstęp
- PBMC są kluczowe dla analizy funkcji i zaburzeń układu odpornościowego.
- Kriokonserwacja umożliwia analizę próbek niezależnie od czasu ich pobrania.
- Zamrażanie i rozmrażanie mogą uszkodzić komórki, co wpływa na wyniki eksperymentów.
- Zstandaryzowane metody zwiększają powtarzalność wyników w różnych badaniach.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu kriokonserwacji PBMC.
- Zapewnienie braku zmian w parametrach bioenergetycznych po rozmrożeniu.
- Umożliwienie prowadzenia badań wieloośrodkowych poprzez przechowywanie próbek do późniejszej analizy.
Zastosowane metody
- Znormalizowane przygotowanie PBMC z krwi pełnej.
- Kontrolowane techniki kriokonserwacji.
- Ocena parametrów bioenergetycznych po rozmrażaniu.
- Porównanie wyników z różnych ośrodków pobierania próbek.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie konserwuje PBMC bez ich uszkadzania.
- Pomiary bioenergetyczne pozostają spójne po rozmrożeniu.
- Próbki mogą być pobierane z różnych lokalizacji i analizowane wspólnie.
Wnioski
- Niezawodna kriokonserwacja PBMC zwiększa możliwości badawcze.
- Ustandaryzowane metody poprawiają jakość badań nad funkcjami układu odpornościowego.
- Podejście to wspiera badania wieloośrodkowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niezawodna kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna PBMC umożliwiają spójne gromadzenie próbek w wielu ośrodkach oraz ich scentralizowaną analizę, co pozwala rozwiązać wyzwania logistyczne i czasowe w badaniach translacyjnych. Takie podejście wspiera wysoką wiarygodność oceny funkcji mitochondriów, która jest kluczowa w badaniach nad starzeniem się oraz chorobami metabolicznymi. Zstandaryzowane protokoły postępowania z PBMC zwiększają wartość prognostyczną i usprawniają podejmowanie decyzji portfelowych we wczesnych fazach odkrywania leków oraz w badaniach nad biomarkerami.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rzetelną analizę funkcji mitochondriów w małoinwazyjnych próbkach ludzkich.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zapewnienie stabilności parametrów bioenergetycznych po kriokonserwacji.
- Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów dla szlaków metabolicznych oraz chorób związanych z wiekiem.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane preparaty PBMC dla powtarzalnych późniejszych analiz bioenergetycznych.
- Zapewnia standaryzację i porównywalność analiz pomiędzy próbkami świeżymi a kriozachowanymi.
- Umożliwia skalowalne, wieloośrodkowe pobieranie próbek w celu przygotowania do przesiewów wysokoprzepustowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie pomiarów bioenergetycznych opartych na PBMC z translacyjnymi biomarkerami istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość procesu od pobrania próbek klinicznych po przedkliniczną analizę funkcji mitochondriów.
- Wspiera decyzje dotyczące rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez minimalizację zmienności próbek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje procesy od wczesnego etapu odkrywania po badania translacyjne, umożliwiając scentralizowaną analizę funkcji mitochondriów w PBMC w wieloośrodkowych badaniach klinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w próbkach pochodzenia ludzkiego.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki bioenergetyczne do opracowywania testów.
- Analityka: Zapewnia spójne pomiary żywotności komórek, poziomów ATP oraz aktywności łańcucha oddechowego.
- Badania translacyjne: Łączy pobieranie próbek klinicznych z przedkliniczną oceną bioenergetyczną.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zstandaryzowany, wielokrotnie wykorzystywany protokół kriokonserwacji PBMC dla różnorodnych badań.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad mitochondriami.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność procedur z wykorzystaniem PBMC.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez umożliwienie scentralizowanego generowania danych wysokiej jakości.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów związanych z metabolizmem i starzeniem się.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza ekspercka w zakresie izolacji PBMC, kriokonserwacji oraz analiz bioenergetycznych.
- Niezbędny jest dostęp do liczników komórek, zamrażarek z kontrolowaną szybkością chłodzenia oraz platform analitycznych do badania funkcji mitochondriów.
- Wymagana jest standaryzacja protokołów obchodzenia się z próbkami i ich przechowywania pomiędzy ośrodkami.
- Może być konieczna adaptacja procedur w zależności od objętości krwi lub kohort pacjentów z różnymi jednostkami chorobowymi.
- Należy rutynowo weryfikować porównywalność próbek świeżych i kriokonserwowanych.
