Mikrofluidyczna pułapka hydrodynamiczna dla pojedynczych cząstek

Ogólnym celem tej metody jest ograniczanie i manipulowanie pojedynczymi cząsteczkami w skali mikro i nano przy użyciu przepływu laminarnego w urządzeniu mikrofluidycznym. Pułapka hydrodynamiczna składa się z urządzenia mikrofluidycznego o geometrii kanałów w kształcie krzyża, co powoduje powstanie przepływu z punktem stagnacji na złączeniu mikrokanałów. Zawór zintegrowany z układem, znajdujący się w jednym z kanałów wylotowych, służy do aktywnego sterowania przepływem cieczy i wychwytywania cząsteczek.

Cząstki są zatrzymywane w określonym przez użytkownika punkcie referencyjnym poprzez aktywną kontrolę położenia punktu stagnacji. Do śledzenia pozycji cząstek oraz regulacji zaworu na chipie w celu utrzymania cząstki w punkcie referencyjnym wykorzystuje się regulator sprzężenia zwrotnego. Dzięki zastosowaniu pułapki hydrodynamicznej pojedyncze cząstki są chwytane w rozcieńczonych lub stężonych roztworach i mogą być obrazowane przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej lub jasnego pola.

Pojedyncza cząstka może zostać ograniczona do obszaru jednego mikrona od centrum pułapki, co przedstawiono na wykresie trajektorii cząstki oraz na histogramie przemieszczenia cząstki względem centrum pułapki. Cześć, jestem Eric Johnson Rio z laboratorium profesora Charlesa Schroera w Katedrze Inżynierii Chemicznej i Biomolekularnej oraz w Centrum Biofizyki i Biologii Obliczeniowej na Uniwersytecie Illinois. Cześć, nazywam się Ari, jestem badaczem postdoc w laboratorium Schroera.

Witajcie, nazywam się Cheryl Schroeder i dzisiaj pokażemy Państwu, jak wykonać i zastosować urządzenie mikrofluidyczne do hydrodynamicznego wychwytywania pojedynczych cząstek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pułapki optyczne czy elektrokinetyczne, jest to, że wychwytywanie hydrodynamiczne odbywa się wyłącznie dzięki przepływowi cieczy, co eliminuje potencjalnie zakłócające pola sił podczas pułapkowania nanocząstek lub komórek. Technika ta ma potencjał przekształcić naukę podstawową i stosowaną, umożliwiając wychwytywanie cząstek w skali mikro i nano w wolnym roztworze, bez żadnych wymagań dotyczących właściwości chemicznych lub fizycznych wychwytywanej cząstki.

Zacznijmy zatem. Aby ułatwić oddzielanie replik od form z SU-8, należy zmodyfikować powierzchnię form, umieszczając wafle w eksykatorze pod próżnią przez 10 minut wraz z szalką szklaną zawierającą kilka kropli trichlorosilanu, wykorzystując mieszaninę PDMS od Dow Corning dla warstw przepływowych i sterujących. Naniesienie metodą spin-coatingu mieszaniny PDMS w stosunku 15:1 na formę warstwy przepływowej należy przeprowadzić przez 30 sekund przy prędkości 750 RPM, a następnie umieścić wafel w szalce Petriego.

Analogicznie, umieść formę warstwy kontrolnej w szalce Petriego i wlej na nią mieszaninę PDMS w stosunku pięć do jednego, osiągając grubość 4 mm. Aby częściowo utwardzić warstwy PDMS, wypiecz wafle/PDMS przez 30 min w temperaturze 70 °C, a następnie pozostaw je do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Wytnij replikę PDMS skalpelem i odklej ją od formy z SU-8.

Następnie za pomocą igły o rozmiarze 21 G wykonaj w PDMS otwór, który będzie służył jako port dostępu do mikrokanału pełniącego funkcję zintegrowanego z układem zaworu membranowego. Umieść replikę PDMS z warstwą sterującą na płytce z naniesioną metodą spin-coatingu fluidyczną warstwą PDMS. Przy użyciu stereomikroskopu ostrożnie wyrównaj i połącz warstwę sterującą z warstwą fluidyczną.

Należy upewnić się, że między warstwami nie pozostały pęcherzyki powietrza, a następnie wypiekać w temperaturze 70 °C przez noc, aby w pełni utwardzić obie warstwy w monolityczną płytkę PDMS. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej za pomocą skalpela odciąć i odkleić replikę PDMS z formy SU-8, a następnie za pomocą żyletki usunąć nadmiar PDMS i oddzielić od siebie poszczególne jednostki urządzenia. Następnie wykonać otwory dostępowe do mikrokanałów w warstwie fluidycznej za pomocą igły o rozmiarze 21 G. Oczyścić szkiełko nakrywkowe acetonem i IPA, a następnie osuszyć strumieniem azotu.

Potraktuj powierzchnie szkiełka podstawowego oraz repliki z PDMS plazmą tlenową pod ciśnieniem 500 millitorr przez 30 sekund. Następnie niezwłocznie doprowadź do kontaktu obu powierzchni, aby utworzyć nieodwracalne uszczelnienie. Na koniec wypiecz urządzenia przez noc, aby zwiększyć adhezję między warstwami PDMS a szkiełkiem podstawowym.

W pierwszej kolejności należy umieścić urządzenie mikrofluidyczne na stoliku mikroskopu odwróconego i zabezpieczyć je uchwytami stolika. Następnie, aby dostarczyć roztwory do urządzenia mikrofluidycznego, należy napełnić strzykawkę szczelną gazowo o pojemności 1 ml buforem, a strzykawkę o pojemności 250 µL roztworem próbki. Do kontrolowania podawania próbki należy użyć zaworu T pomiędzy strzykawką z próbką a portem wlotowym próbki w urządzeniu mikrofluidycznym.

Następnie należy ustanowić połączenia płynowe pomiędzy strzykawkami a urządzeniem mikrofluidycznym, używając rurek z perfluoropolimeru, adapterów typu luer lock oraz metalowych rurek o rozmiarze 24 G. Następnie należy ustanowić połączenia płynowe dla kanałów wylotowych w urządzeniu mikrofluidycznym, wykorzystując rurki PFA i metalowe rurki o rozmiarze 24 G. Aby utrzymać stały spadek ciśnienia pomiędzy strzykawkami a kanałami wylotowymi, rurki PFA dla wylotów powinny mieć taką samą długość i obie powinny być zanurzone w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej roztworem buforowym.

Napełnij zawór na chipie fluorowanym olejem nośnym, używając plastikowej strzykawki 3 ml z końcówką luer lock, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do warstwy fluidycznej podczas pracy. Wypchnij powietrze z komory zaworu przez membranę PDMS do mikrokanału w warstwie fluidycznej.

Do obsługi zaworów na chipie. Podłączyć zasilanie sprężonym gazem obojętnym do portu w warstwie sterującej. Przepłukać połączenia płynowe oraz urządzenie mikrofluidyczne 0,5 milliliters roztworu buforowego, aby upewnić się, że z układu, w tym z kanałów wylotowych, usunięto wszystkie pęcherzyki powietrza.

Typowe przepływy stosowane do usuwania pęcherzyków powietrza wynoszą od 2000 do 5000 µL/h. Po wypłukaniu pęcherzyków powietrza z kanałów mikrofluidycznych należy zmniejszyć przepływ do 50–100 µL/h, co stanowi typowy wolumetryczny przepływ dla wychwytywania cząstek. Następnie należy przełączyć zawór T, aby umożliwić przepływ próbki do urządzenia mikrofluidycznego. Należy uruchomić dedykowany kod LabVIEW, który automatyzuje proces wychwytywania cząstek poprzez implementację algorytmu liniowego sterowania sprzężeniem zwrotnym.

Kod przechwytuje obrazy z kamery CCD i przesyła potencjał elektryczny do regulatora ciśnienia, który aktywnie moduluje położenie pneumatycznego zaworu na chipie. Używając stolika mikroskopu w osiach XY, ustaw obszar pułapkowania w centrum pola widzenia kamery. Ustaw obszar pułapkowania w ognisku obiektywu i dostosuj ustawienia kamery, aby zoptymalizować warunki obrazowania.

Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w polu widzenia kamery w taki sposób, aby środek ROI znajdował się w pozycji środka pułapki. Następnie zainicjuj ciśnienie offsetowe przyłożone do zaworu na chipie. Zwężenie o szerokości od 100 do 200 mikronów znajduje się w przeciwległym kanale wylotowym.

Zapewnia ciśnienie offsetowe dla pracy zaworu zintegrowanego w układzie. Uruchom kontroler sprzężenia zwrotnego i dostrój wzmocnienie proporcjonalne, aby zoptymalizować odpowiedź pułapki. W zależności od natężenia przepływu i położenia zaworu zintegrowanego w układzie istnieje optymalna wartość wzmocnienia proporcjonalnego, która zwiększa stabilność pułapki i eliminuje niepożądane oscylacje cząsteczek.

Kod LabVIEW automatycznie przechwyci jedną z cząsteczek wnikających do obszaru pułapki. W tym filmie ruch cząsteczek w kierunku dopływu wynika z faktu, że strumień wlotowy próbki pozostaje otwarty, aby zmaksymalizować szczelność uwięzienia w tym kierunku. Użytkownik może zamknąć strumień próbki podczas pułapkowania, co zrównoważy przepływ do złącza kanału poprzecznego, umożliwi monitorowanie uwięzionej cząsteczki oraz utrzymanie jej w płaszczyźnie obrazu za pomocą ręcznego ustawiania ostrości lub zautomatyzowanego systemu mikroskopowego.

Zintegrowane urządzenie mikrofluidyczne składa się z układu ogniskowania próbki, skrzyżowania szczelinowego oraz zaworu pneumatycznego; chwytanie odbywa się na skrzyżowaniu szczelinowym, a pozycja cząstki jest kontrolowana poprzez aktywną regulację pola przepływu na połączeniu mikrokanałów za pomocą zaworu pneumatycznego. Przedstawiono tutaj obraz pojedynczej kuleczki uwięzionej w pułapce hydrodynamicznej. Oprócz kuleczki w centrum pułapki, w obszarze chwytania na skrzyżowaniu szczelinowym widocznych jest kilka nieuwięzionych kuleczek.

Mapowana jest trajektoria uwięzionej fluorescencyjnej kulki polistyrenowej o średnicy 2,2 mikrona. Cząstka jest początkowo uwięziona przez trzy minuty. Następnie zostaje zwolniona z pułapki i ucieka przez jeden z kanałów wylotowych.

Histogram przemieszczenia uwięzionej kuleczki względem centrum pułapki w kierunku kanałów wylotowych wskazuje, że cząsteczka jest ograniczona do obszaru jednego mikrona od centrum pułapki. Przedstawiliśmy pułapkę EM jako metodę uwięzienia cząsteczek w skali mikro i nano w wolnym roztworie z wykorzystaniem przepływu w punkcie stagnacji generowanego wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego. Pułapkowanie hydrodynamiczne umożliwia unieruchomienie pojedynczej cząsteczki docelowej w stężonych zawiesinach cząsteczek, co jest trudne do osiągnięcia przy użyciu alternatywnych metod pułapkowania opartych na polach sił.

Po dalszym rozwoju ta nowa technika umożliwi badania naukowe w dziedzinach biofizyki, mechaniki komórki, dynamiki płynów, enzymologii i biologii systemowej. Dziękujemy za oglądanie i mamy nadzieję, że ta technika okaże się przydatna w Państwa eksperymentach.