Wychwytywanie komórek przy użyciu urządzenia mikrofluidycznego

Przygotowane przez nas urządzenia są pakowane w zestawy po 10 lub 20 sztuk; po dostarczeniu przesyłka znajduje się w chłodniczym pudełku, a zestaw zawiera wszystkie komponenty niezbędne do przeprowadzenia eksperymentu. W skład zestawu wchodzi pakiet zawierający wszystkie strzykawki i bufory, które mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej. Dołączona jest również kopia protokołu, zgodnie z którym będziemy postępować w tym doświadczeniu.

Znajduje się również chłodnia, w której umieszczone są właściwe urządzenia oraz wszystkie bufory robocze wymagające przechowywania w niskiej temperaturze. Zazwyczaj zestawy są pakowane w grupach po 10 lub 20 sztuk. Gdy zestawy nie są używane, powinny być przechowywane w chłodziarce.

Każda strzykawka i każdy element zestawu są starannie oznakowane, a etykiety odpowiadają tabeli w protokole, według którego postępujemy. Dzięki temu nie ma wątpliwości co do tego, której strzykawki lub elementu zestawu należy użyć w poszczególnych krokach. Po rozpakowaniu urządzeń i umieszczeniu ich w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przeprowadzimy procedurę izolacji neutrofili i ich lizy do późniejszych zastosowań genomicznych, ponieważ otrzymany lizat komórkowy zostanie wykorzystany do izolacji lub ekstrakcji RNA.

Z tego powodu chcemy mieć pewność, że nasz obszar roboczy jest czysty, nie tylko w sensie sterylnym, ale także wolny od wszelkich RNA, które zazwyczaj występują w środowisku. Bardzo ważne jest zatem przetarcie całej powierzchni roboczej oraz urządzeń roztworem niszczącym RNA. Zazwyczaj przecieramy wszystkie narzędzia i powierzchnie robocze preparatem RNA SAP lub RNase AWAY, które są dostępne u wielu producentów.

Urządzenie dostarczono w zapieczalnym woreczku. Każde urządzenie jest szczelnie zamknięte i posiada kod kreskowy. Należy zapisać ten kod kreskowy, jeśli pracujesz z jakimikolwiek próbkami klinicznymi.

Urządzenie zostaje zatem rozszczelnione, pokrywa zostaje zdjęta, a całość umieszczona w urządzeniu trzymającym pompę. Jako próbka krwi wykorzystywana jest krew pełna. Przepływać będzie ona przez standardową strzykawkę BD o pojemności 1 ml, oznaczoną jako strzykawka jeden.

Zazwyczaj strzykawkę wyjmuje się z opakowania, a z probówki z krwią ostrożnie zdejmuje się korek. Następnie pobiera się 700 µL lub 0,7 ml krwi i wstrzykuje połowę tej objętości, czyli 350 µL, do probówki 1,5 ml. W ten sposób krew może zostać przekazana do dalszej obróbki.

Państwa probówka z krwią może zostać przekazana do dalszej analizy, a jednocześnie wciąż pozostanie zapas krwi na wypadek awarii urządzenia. Teraz załadujemy strzykawkę zawierającą krew na tę igłę, która jest połączona za pomocą odcinka rurki z tym urządzeniem. Musimy zachować szczególną ostrożność w obchodzeniu się z tym mikrofluidycznym urządzeniem do izolacji.

Musimy bardzo uważać, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza do urządzenia, w przeciwnym razie urządzenie nie będzie działać prawidłowo. Zazwyczaj robimy to w następujący sposób: bierzemy strzykawkę, naciskamy tłok i dodajemy ciecz na górną powierzchnię urządzenia, upewniając się, że jest ona całkowicie zwilżona, zanim opróżnimy cały płyn. Następnie zatrzymujemy się i ostrożnie oddzielamy korpus strzykawki od igły, wypełniając końcówkę igły lub złączy luer igły pozostałym w strzykawce buforem.

Usuwamy to. Następnie bierzemy strzykawkę z krwią i wprowadzamy ją do tego przyłącza z luteką, uważając, aby nie rozlać krwi oraz nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.

Zaleca się trzymać korpus strzykawki oraz dren, aby zapobiec rozlaniu krwi. Po połączeniu strzykawki z obudową drenu lub igłą, należy kilkukrotnie energicznie w nią stuknąć, aby usunąć pęcherzyki powietrza, które mogą znajdować się przy złączu. Następnie strzykawkę umieszcza się w pompie strzykawkowej i zabezpiecza za pomocą śruby blokującej.

Pompa strzykawkowa zostaje włączona; jest ona już zaprogramowana zgodnie z naszymi warunkami przepływu. Krew będzie przepływać przez urządzenie z prędkością 30 µL na minutę. Po umieszczeniu korpusu strzykawki w pompie strzykawkowej naciskamy przycisk na ruchomym ramieniu tłoka i przesuwamy je w dół, aż dotknie ono góry tłoka i zacznie wypychać ciecz przez jego końcówkę.

Jest to igła ze stali nierdzewnej z tępym zakończeniem. Po upewnieniu się, że system jest odpowietrzony, naciśniemy przycisk run. Aby rozpocząć przepływ krwi, należy nacisnąć stop w celu jego zatrzymania, a następnie pobrać czystą probówkę do wirowarki o pojemności 1.5 mil lub probówkę fendor i ostrożnie odłączyć połączenie.

Odłącz tylko jeden przewód, wyjmując go z jednego portu urządzenia. Po odłączeniu tego przewodu wprowadzimy go do probówki typu fendor o pojemności 1,5 ml. Następnie naciśniemy przycisk start, aby ponownie rozpocząć przepływ krwi.

Gdy pojawi się kropla krwi, zatrzymujemy pompę i wstawiamy ją do wlotu, który właśnie otworzyliśmy w urządzeniu. Naciskamy przycisk start, aby rozpocząć przepływ krwi, i ustawiamy minutnik na pięć minut. Musimy upewnić się, że krew równomiernie wypełnia wszystkie komory i że w urządzeniu nie ma widocznych pęcherzyków powietrza.

Jeśli pojawią się pęcherzyki powietrza blokujące przepływ do którejkolwiek z komór, można użyć pęsety i przesunąć ją wzdłuż małych kanałów prowadzących do komór wychwytujących lub kanałów odpływowych z komór wychwytujących. Urządzenie napełnia się prawidłowo, więc po pięciu minutach należy nacisnąć przycisk stop w pompie strzykawkowej, aby zatrzymać przepływ krwi, poluzować zacisk strzykawki i wyjąć ją z uchwytu pompy strzykawkowej. Następnie użyjemy strzykawki numer trzy, wypełnionej PBS wolnym od nukleaz. Ponownie upewnimy się, że powierzchnia urządzenia jest zwilżona, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, a następnie ostukamy strzykawkę, aby upewnić się, że wszelkie pęcherzyki powietrza znajdują się w górnej części korpusu strzykawki.

Poluzuj ramię pompy strzykawkowej i włóż strzykawkę o pojemności 3 ml do pompy. Dokręć ją, a następnie przesuń tłok w dół, aż zetknie się on z tłokiem strzykawki. Uruchamiamy pompę i czekamy, aż ciecz wypełni urządzenie, aż do momentu pojawienia się kropli na końcówce igły ze stali nierdzewnej.

Gdy zauważysz tworzącą się kroplę, zatrzymaj pompę. Wyjmij stalową końcówkę z krwią. Następnie włóż bufor płuczący i naciśnij przycisk start.

Pozostawimy to urządzenie w działaniu przez pięć minut. Należy użyć czystej chusteczki i wytrzeć niewielką ilość krwi, która może znajdować się przy wlocie lub wylocie. Po pięciu minutach przepłukiwania urządzenia buforem płuczącym, powinno ono zostać całkowicie oczyszczone z krwi; będzie to widoczne po całkowitym zniknięciu czerwonej krwi z urządzenia, które stanie się przejrzyste. Po upływie pięciu minut zatrzymamy przepływ buforu płuczącego.

Następnie zdejmiemy strzykawkę z pompy strzykawkowej. Zamkniemy probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, bezpośrednio na elastycznym przewodzie wylotowym. Następnie ostrożnie podniesiemy probówkę, wyciągając przewód odpływowy z urządzenia.

Wyrzucimy to do pojemnika na odpady biologiczne. W zestawie znajduje się nowa rurka wylotowa, wykonana z teflonu. Posiada ona również końcówkę ze stali nierdzewnej.

Wymienimy stary przewód wylotowy na ten nowy przewód wylotowy. Weźmiemy ten przewód wylotowy i spróbujemy go zgiąć w kształt litery U lub V. W zestawie znajduje się również kolumna do rozdrabniania Kaya, która ścina DNA i w zasadzie homogenizuje lizat komórkowy.

Otworzymy fioletową zakrętkę kolumny do shreddera i umieścimy rurkę wylotową w kolumnie Kay Shredder. Wyjmiemy z zestawu strzykawkę numer dwa, przeznaczoną do RLT. Jest to standardowa strzykawka BD o pojemności 1 ml z tępą igłą ze stali nierdzewnej o rozmiarze 22 gauge.

Użyjemy tego do wstrzyknięcia 350 µL standardowego buforu RLT firmy Qiagen do urządzenia. Ponieważ urządzenie posiada objętość martwą wynoszącą około 50 µL, wstrzykniemy RLT, a następnie za nim wprowadzimy poduszkę powietrzną, aby wypchnąć objętość martwą urządzenia do kolumny rozdrabniającej. Zrobimy to w następujący sposób: za pomocą strzykawki pobierzemy 350 µL powietrza, a następnie 350 µL lub 0,35 ml RLT, tak aby RLT znajdowało się na dole strzykawki.

Należy powstrzymać się od odwracania strzykawki i wstrzykiwania powietrza. Powietrze ma zapewnić całkowite przeniesienie RLT do kolumny do rozdrabniania Kay. Teraz wyciągniemy cewkę z buforu płuczącego.

Wprowadzamy strzykawkę z RLT i powoli wstrzykujemy RLT do urządzenia przez około 30 sekund, upewniając się, że rurka wylotowa odprowadza odpady do kolumny Kay Shredder. Gdy do urządzenia zacznie dostawać się powietrze, naciskamy tłok i czekamy, aż cały płyn zostanie zwolniony do kolumny Kay Shredder. Wyjmujemy kolumnę Kay Shredder i wirujemy ją w mikrocentryfudze z przeciwwagą przy 15 000 RPM lub maksymalnej prędkości obrotowej w mikrocentryfudze laboratoryjnej przez dwie minuty.

Po wirowaniu kolumny przez dwie minuty wyjmujemy z niej próbkę, która znajduje się obecnie w buforze RLT, i umieszczamy ją w jednej z dołączonych probówek kriogenicznych z fioletowym zakrętką. Jeśli pracują Państwo z próbką kliniczną, probówki te należy opisać na początku eksperymentu. Oto lizat w probówce kriogenicznej.

Tę probówkę kriogeniczną natychmiast umieszcza się w zamrażarce -80 °C i przechowuje do czasu wysyłki lub późniejszej ekstrakcji RNA. Jest to alternatywny protokół izolacji neutrofili. Zamiast lizować komórki buforem RLT, zabarwimy je standardowym barwnikiem histologicznym.

Barwienie. Wyjmujemy zapieczętowane urządzenie z torby i rozpakowujemy je, zapisujemy numer partii urządzenia, a następnie umieszczamy szalkę Petriego w uchwycie do szalek Petriego.

Wyjmij strzykawkę 1 ml z opakowania (strzykawka nr 1), pobierz do niej 700 µL krwi, a następnie wstrzyknij połowę tej objętości (350 µL) do probówki eend DPH. Odstaw ją na bok. Następnie weź strzykawkę nr 4 z podłączonym przewodem, którego użyjemy do podania próbki, i wstrzyknij krew do urządzenia.

Podstawę igły przy końcówce rurki należy utrzymać w sposób właściwy dla pracy w laboratorium chemicznym. Należy zdjąć korpus strzykawki i napełnić końcówkę. Adapter służy do buforowania, a następnie należy zutylizować tę strzykawkę.

Wprowadzimy strzykawkę zawierającą krew do igły, używając chusteczki do czyszczenia chemicznego w celu zebrania ewentualnych wycieków. Opukiemy strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza w miejscu połączenia igły z korpusem strzykawki. Umieścimy strzykawkę w pompie strzykawkowej, a następnie odpowietrzymy przewody, naciskając ruchome ramię pompy.

Odłączymy rurkę od jednego z wylotów urządzenia, urządzenia przechwytującego, i umieścimy ją w probówce einor 1,5 ml. Następnie rozpoczniemy przepływ krwi, naciskając przycisk run na pompie strzykawkowej. Odczekamy, aż na stalowej końcówce utworzy się kropla krwi.

Po utworzeniu się kropli należy nacisnąć przycisk stop, odsączyć krew, wprowadzić ją do urządzenia i nacisnąć run. Następnie ustawiamy czasomierz na pięć minut. Po przepływie przez urządzenie przez pięć minut należy nacisnąć przycisk stop na pompie strzykawkowej i zwolnić strzykawkę.

Następnie zastąpimy tę strzykawkę strzykawką 3 ml zawierającą bufor płuczący, którym jest 1x PBS. Ponownie upewnijmy się, że góra urządzenia jest szczelna, a następnie usuniemy końcówkę igły zawierającą krew lub roztwór. Rozpoczynamy przygotowanie urządzenia (priming).

Gdy powstanie kropla, wkładamy ją do urządzenia i naciskamy przycisk uruchomienia, osuszając wszelką krew przy wlocie lub w przewodzie wylotowym, a następnie pozwalamy na przepływ przez pięć minut po etapie płukania. Ponownie zatrzymamy pompę strzykawkową i wyjmiemy strzykawkę z uchwytu pompy. Aby przeprowadzić standardowe barwienie GIM, najpierw utrwalimy komórki i odwodnimy je, używając 100%metanolu.

Zatem mamy strzykawkę, strzykawkę 3 ml wstępnie napełnioną metanolem. Ponownie odpowietrzymy strzykawkę, aby upewnić się, że metanol przepływa, zatrzymamy pompę strzykawkową, włożymy ją do urządzenia i naciśniemy przycisk start. Będziemy utrwalać próbki w tym roztworze metanolu przez 2 do 4 minut.

Po dwóch do czterech minutach utrwalania i przepłukiwania metanolem zatrzymujemy pompę, opróżniamy strzykawkę z metanolem, a następnie nabieramy do strzykawki o pojemności 3 ml standardowy barwnik EEM Sustain od firmy Sigma, rozcieńczony w stosunku 1:5 w wodzie dejonizowanej. Po rozcieńczeniu zawartość nabieramy do strzykawki, a na jej końcu mocujemy filtr 0,8 µm, aby odfiltrować wszelkie cząsteczki, które mogłyby doprowadzić do zatkania urządzenia. Barwienie trwa od 5 do 10 minut.

Następnie opłuczemy urządzenie wodą dejonizowaną. Po 5 do 10 minutach barwienia zatrzymamy pompę strzykawkową i zamienimy strzykawkę z buforem barwiącym na strzykawkę zawierającą wodę dejonizowaną. Będziemy płukać urządzenie do momentu, aż niebieski kolor SAI zostanie z niego całkowicie usunięty. Po wypłukaniu nadmiaru gim sustain zatrzymamy podawanie roztworu płuczącego.

Następnie wyjmiemy strzykawkę z wodą z wlotu. Potem weźmiemy rurkę wylotową urządzenia. Chwycimy tę rurkę na końcu za pomocą pęsety.

Jest to elastyczna rurka teflonowa, którą włożymy z powrotem do wlotu urządzenia. Uszczelnia to urządzenie, utrzymuje nawodnienie komórek oraz pozwala zachować ich morfologię. Teraz mój współpracownik, dr John Hong Chang, zaprezentuje alternatywny protokół izolacji limfocytów CD4+, a następnie barwienie immunofluorescencyjne bezpośrednio w urządzeniu mikroprzepływowym.

Nazywam się Shong Hong i dzisiaj zaprezentuję Państwu barwienie komórek w urządzeniu mikroprzepływowym. Na poprzednim etapie pokazałem już, jak wykorzystać urządzenie do mikroprzepływowej izolacji immunoafinicyjnej do specyficznego wyodrębniania komórek krwi z nieprzetworzonej krwi pełnej. W tamtym celu należało poddać komórki lizie, aby uzyskać zawartość białek i DNA z wyizolowanych komórek. W ramach moich badań interesuje mnie natomiast pozyskanie samych komórek, a następnie określenie ich liczby – na przykład w celu policzenia komórek CD4 z krwi pełnej i wykorzystania tej wartości jako wskaźnika do celów diagnostycznych.

Urządzenie, którego używamy, jest bardzo podobne do urządzenia Kena. Wykonano je z prostej komory z PDMS. Geometria jest nieco inna, więc parametry pracy również się różnią, choć w ogólnym ujęciu cała procedura obsługi jest bardzo podobna.

Pominiemy zatem wszystkie etapy wychwytywania i płukania komórek i przejdziemy bezpośrednio do etapu barwienia komórek w procedurach zliczania. Mam tutaj urządzenie, w którym komórki z krwi pełnej zostały już częściowo wychwycone, a samo urządzenie zostało już wypłukane PBS. Zatem komórki spoza grupy docelowej zostały już wypłukane z urządzenia, a ja przygotowałem wcześniej mieszaninę przeciwciał, która służy konkretnie do znakowania komórek wyizolowanych w urządzeniu.

Stężenie przeciwciał zastosowane w tej procedurze zostało zoptymalizowane w celu barwienia komórek z bardzo wysoką intensywnością fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym. Sama procedura jest dość prosta. Załadowujemy strzykawkę wypełnioną roztworem przeciwciał do pompy strzykawkowej, a następnie upewniamy się, że prędkość przepływu została ustawiona zgodnie z wymaganymi parametrami.

Następnie uruchomimy pompę strzykawkową i będziemy obserwować końcówkę rurki, upewniając się, że roztwór już wypływa, aby w rurce nie było już pęcherzyków powietrza. Możemy wtedy podłączyć rurkę do urządzenia mikroprzepływowego, w którym przechwycone zostały komórki. W ten sposób przeciwciało wpływa do urządzenia, aby zabarwić komórki izolowane wewnątrz niego; w tym przypadku stosuję przepływ 5 µL/min, jednak w zależności od geometrii urządzenia mogą istnieć inne parametry przepływu, których będziesz potrzebować w swoich zastosowaniach.

Następnie przepuścimy roztwór przeciwciał przez pięć minut, co zapewni objętość wystarczającą do wymiany całego roztworu w kanale mikroprzepływowym. Po wstrzyknięciu przeciwciał zatrzymamy przepływ. Zatem wprowadzamy przeciwciała z przepływem 5 µL/min przez pięć minut, aby wymienić cały roztwór w mikrokanale.

Następnie zatrzymujemy przepływ i inkubujemy urządzenie w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Proces ten powinien odbywać się w ciemności, aby zapobiec wygaszeniu fluorescencji przeciwciał podczas inkubacji komórek z przeciwciałem barwiącym. Po barwieniu, które zazwyczaj trwa od 15 do 30 minut, odłączamy rurki od urządzenia i zastępujemy strzykawkę z przeciwciałem strzykawką z buforem, aby wypłukać niezwiązane przeciwciała z urządzenia.

Roztwór płuczący zawiera w tym przypadku 1% BSA w roztworze PBS. BSA jest stosowane w celu zablokowania niespecyficznego wiązania przeciwciał na powierzchni i w ten sam sposób postąpimy tutaj. Najpierw regulujemy szybkość przepływu w pompie strzykawkowej, aby upewnić się, że jest ona zgodna z pożądaną wartością, a następnie uruchamiamy pompę i sprawdzamy, czy ciecz faktycznie wypływa z rurki, zanim podłączymy ją do urządzenia.

Celem tego działania jest usunięcie pęcherzyków powietrza pozostałych w prowadnicach. Dzięki temu podczas wstrzykiwania do urządzenia nie dostanie się żadna bańka powietrza. Następnie podłączamy prowadnice do urządzenia i pozwalamy na przepływ przez kolejne pięć minut, aby wypłukać z urządzenia wszystkie niezwiązane przeciwciała.

Po etapie płukania utrwalimy komórki za pomocą 1% PFA. Celem tego zabiegu jest umożliwienie przechowywania urządzenia przez okres do kilku tygodni, w przypadku gdy obrazowanie nie może zostać przeprowadzone natychmiast. Procedura ta jest zatem bardzo prosta.

Procedura ta jest podobna do działań wykonywanych wcześniej. Mocujemy strzykawkę w pompie, ustawiamy pożądany przepływ, a następnie uruchamiamy pompę strzykawkową i podłączamy przewód do urządzenia, aby wstrzyknąć do niego roztwór paraformaldehydu IDE, który pełni rolę utrwalacza, w celu utrwalenia komórek. Ponownie pozostawiamy go w przepływie przez około pięć minut.

W związku z tym PFA zastępuje cały bufor w urządzeniu, aby utrwalić wszystkie komórki wewnątrz niego. Po etapie utrwalania za pomocą PFA po prostu zdejmujemy strzykawkę z PFA i urządzenie jest gotowe do obrazowania. W niektórych przypadkach użytkownicy chcą przeprowadzić barwienie jąder komórkowych, aby nałożyć ten obraz na barwienie markerów powierzchniowych komórek.

W tym celu na koniec przeprowadzimy barwienie jąder komórkowych przy użyciu DPI. W tym celu należy załadować strzykawkę z DPI, włączyć pompę strzykawkową i wprowadzić DPI do urządzenia. Dzięki temu jądra komórkowe w tych komórkach zostaną zabarwione, co pozwoli wskazać lokalizację komórek.

Obraz barwienia DPI można następnie nałożyć na obraz barwienia markerami powierzchniowymi, aby wskazać lokalizację komórek. Po zakończeniu barwienia DPI należy ponownie wypłukać niezwiązany DPI za pomocą roztworu buforowego. W tym celu ponownie wykorzystujemy PBS zawierający 1% BSA, aby usunąć niezwiązany DPI.

Procedura ta jest analogiczna do wykonanych wcześniej czynności. Wystarczy podłączyć strzykawkę z buforem do urządzenia i pozwolić buforowi przepływać przez nie, aby wypłukać niezwiązany DAP. To cały proces barwienia komórek w urządzeniu mikroprzepływowym.

Po zakończeniu wszystkich procedur barwienia urządzenia są gotowe do obrazowania. Dzięki utrwaleniu w PFA urządzenia mogą być również przechowywane przez kilka tygodni, jeśli obrazowanie nie mogłoby zostać wykonane od razu.