Wykorzystanie panwirusej macierzy mikroarray (Virochip) do przesiewowego badania próbek klinicznych w kierunku patogenów wirusowych

W niniejszej procedurze wykorzystano chip Viro, czyli panwiralesową analizę mikroarray do badania próbek klinicznych w kierunku znanych i nieznanych wirusów. W pierwszej kolejności z próbek klinicznych izoluje się kwasy nukleinowe. Następnie wyekstrahowane RNA poddaje się odwrotnej transkrypcji z wykorzystaniem starterów losowych.

Przeprowadzono syntezę drugiej nici CD NA, a następnie bibliotekę CD NA powielono za pomocą losowego PCR. Następnie powielone cd NA oznakowano barwnikami fluorescencyjnymi i poddano hybrydyzacji z macierzą mikroprzewodową typu viral chip. Ostatnim krokiem jest skanowanie i analiza mikromacierzy.

Ostatecznie, dzięki analizie mikroarray na chipie można uzyskać wyniki wykazujące obecność lub brak jednego lub kilku wirusów. Metody detekcji o szerokim spektrum, takie jak mikroarray wirusowy, są niezbędne w mikrobiologii diagnostycznej, ponieważ powszechne zespoły kliniczne, takie jak zapalenie płuc, nie są specyficzne dla żadnego pojedynczego patogenu, a dodatkowo istnieje stałe zagrożenie pojawieniem się nowych patogenów wirusowych, takich jak koronawirus SARS czy nowy wirus grypy H1N1 z 2009 roku. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii diagnostycznej, np. jaki procent niezdiagnowanych infekcji w warunkach klinicznych może być wywołany przez dotychczas niezidentyfikowane nowe wirusy. Zastosowanie tej techniki prowadzi do lepszej diagnostyki ostrych schorzeń klinicznych w szpitalach, ponieważ pozwala ona na jednoczesne badanie obecności od setek do tysięcy potencjalnych patogenów.

Pomysł na tę metodę pojawił się u nas w 2002 roku, kiedy zdecydowaliśmy się zastosować nowo opracowaną technologię mikromacierzy, zapoczątkowaną w laboratorium dr. Josepha DeRisiego na UCSF, do wykrywania wirusów. Naszym pierwszym przypadkiem testowym w warunkach rzeczywistych było wykorzystanie chipa wirusowego do identyfikacji nowego koronawirusa odpowiedzialnego za SARS w 2003 roku; całą procedurę od początku do końca zaprezentuje technik z mojego laboratorium, który zademonstruje użycie testu z chipem wirusowym na próbce wymazu z nosa pobranej od dziecka w celu zdiagnozowania przyczyny ostrej choroby dróg oddechowych. Próbki wymazów z nosogardzieli zbierane są w sterylnych pojemnikach zawierających płynne medium transportowe dla wirusów i przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy odmrozić probówkę zawierającą próbkę, a następnie krótko wymieszać wymaz w medium przed wyrzuceniem wymazu do pojemnika na odpady biologiczne. Następnie należy odpipetować 200 µL próbki do probówki o pojemności 1,5 mL. Próbkę należy przepuścić przez filtr wirówkowy 0,22 µm w celu oczyszczenia cząstek wirusowych i zebrać ją do nowej probówki 1,5 mL.

Następnie, zgodnie z instrukcjami producenta, należy użyć zestawu Turbo DNA firmy Ambien w celu degradacji genomowego DNA gospodarza i oczyszczenia chronionych, enkapsydowanych kwasów nukleinowych wirusa. Po tym kroku należy przeprowadzić ekstrakcję RNA, korzystając z zestawu do ekstrakcji wirusowego RNA XMO ZR lub zestawu do wirusów Qiagen ultrasound, zgodnie z instrukcjami producenta. Stężenie wyekstrahowanego RNA należy zmierzyć za pomocą spektrofotometru kwasów nukleinowych NanoDrop.

Stężenie RNA powinno wynosić preferencyjnie co najmniej 10 nanogramów na mikrolitr, jednak może ono różnić się w zależności od próbki, przy użyciu cienkościennej probówki o objętości 200 mikrolitrów. Do czterech mikrolitrów wyekstrahowanego RNA należy dodać jeden mikrolitr primera A o stężeniu 40 PICA moli na mikrolitr. Próbkę należy podgrzać do 65 stopni Celsjusza przez pięć minut w termocyklerze, a następnie pozostawić probówkę do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez pięć minut.

Następnie dodaj pięć µL master mix zawierającego dwa µL 5× buforu RT, jeden µL 12,5 mM dNTP, jeden µL wody, 0,5 µL 0,1 M DTT oraz 0,5 µL odwrotnej transkryptazy w termocyklerze. Inkubuj probówkę w temperaturze 42 °C przez 60 minut. Następnie podgrzej próbkę do 94 °C przez dwie minuty.

Aby przerwać reakcję odwrotnej transkrypcji, schłodzić próbkę do 10 °C przez dwie minuty i odwiruć w wirówce pulsacyjnej przez pięć sekund. Następnie dodać 5 µL mieszaniny quease, składającej się z 1 µL buforu quease 5x, 3,8 µL wody i 0,15 µL quease do syntezy drugiej nici. W termocyklerze zwiększyć temperaturę z 10 °C do 37 °C w ciągu ośmiu minut.

Inkubować w temperaturze 37 °C przez osiem minut. Następnie podgrzać do 94 °C przez dwie minuty w celu inaktywacji odwrotnej transkryptazy, a w tym momencie schłodzić do 10 °C. W razie potrzeby przechowywać próbkę zawierającą 15 µL cDNA w temperaturze -20 °C.

Najpierw dodaj 5 µL próbki CD NA do 45 µL mieszaniny master mix składającej się z 5 µL 10x buforu do PCR, 1 µL 12,5 mM dNTP, 1 µL 100 pmol/µL startera B, 1 µL Cleantech LA oraz 37 µL wody. Następnie przeprowadź protokół PCR w następujący sposób: 94 °C przez 2 minuty, a następnie 25 cykli obejmujących 94 °C przez 30 sekund, 50 °C przez 45 sekund i 72 °C przez 1 minutę.

Następnie wykonuje się etap wyżarzania w temperaturze 72 °C przez pięć minut, a po zakończeniu PCR próbki utrzymuje się w temperaturze 10 °C. Produkt PCR należy sprawdzić za pomocą elektroforezy w 1,5% żelu AGE. Powinien być widoczny rozmaz w zakresie od około 200 do 1000 par zasad.

Aby wprowadzić AAD DNTP, dodaj 5 µL produktu PCR wirusa do 45 µL mieszaniny master mix składającej się z 5 µL 10-krotnego buforu do PCR, 1 µL 12,5 mM A-A-D-N-T-P, 1 µL 100 p wielu mikrolitrów startera B, 1 µL ClinTech LA oraz 37 µL wody. Przeprowadź protokół PCR w następujący sposób: 94 °C przez 2 minuty, 15 cykli obejmujących 94 °C przez 30 sekund oraz 50 °C przez 45 sekund.

72 °C przez jedną minutę, a następnie etap wyżarzania w 72 °C przez pięć minut i utrzymanie w 10 °C. Następnie oczyścić nowy produkt PCR za pomocą zestawu DNA clean and concentrator three zgodnie z instrukcjami producenta i rozpuścić w 10 µL buforu elucyjnego. Do 10 µL produktu PCR dodać 1 µL 1 M wodorowęglanu oraz 1 µL si three i inkubować przez jedną godzinę w ciemności.

Następnie ponownie oczyść próbkę oznakowaną S za pomocą zestawu DNA clean and concentrator five i eluuj w 12 µL buforu do elucji. Użyj 1,5 µL próbki do sprawdzenia stężenia cDNA i ilości wbudowanego barwnika na spektrofotometrze NanoDrop. W probówce paskowej do PCR przygotuj mieszaninę: 1 µL 25-krotnego buforu do fragmentacji, 5 µL 5-krotnego buforu blokującego, 9,5 µL lub ilość niezbędna do uzyskania znormalizowanego końcowego stężenia 10 pM lub moli na µL oznakowanej próbki SI3 oraz wody do całkowitej objętości 25 µL. Następnie dodaj 25 µL 2-krotnego buforu do hybrydyzacji GX i krótko odwiruj, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Umieść nową szkiełko z uszczelką w komorze hybrydyzacyjnej. Nanieś 40 µL próbki na szkiełko z uszczelką. Następnie połóż wydrukowany przez Agilent panel wiralny stroną oznaczoną jako Agilent do dołu na szkiełku z uszczelką i mocno dokręć śrubę.

Umieść komorę hybrydyzacyjną w piecu w temperaturze 65 °C i przeprowadzaj hybrydyzację przez noc przy powolnej rotacji z prędkością 10 obr./min w celu przemycia macierzy. Najpierw podgrzej bufor dwa do temperatury 37 °C. Napełnij 500-mililitrowy plastikowy pojemnik około 250 mililitrami buforu jeden.

Wyjmij matrycę z komory hybrydyzacyjnej, zanurz ją i oddziel od slajdu z uszczelką. Przenieś matrycę do czystego pojemnika i przemyj w buforze jeden przez jedną minutę. Następnie użyj oddzielnego plastikowego pojemnika o pojemności 500 ml.

Przemyj matrycę w podgrzanym buforze dwa przez jedną minutę. Po przemyciu powoli wyjmij matrycę z buforu dwa, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.

Użyj chusteczki typu Kimwipe, aby odsączyć nadmiar wilgoci, uważając, aby nie dotykać bezpośrednio aktywnej strony matrycy. Na koniec umieść szkiełko w uchwycie stroną Agilent do góry i włóż je do skanera matryc. W tej procedurze wykorzystujemy skaner mikromacierzy DNA Agilent two micron.

Zeskanuj oznakowaną macierz SI o trzech kanałach w rozdzielczości pięciu mikronów lub dwóch mikronów, zgodnie ze standardowym protokołem skanowania instrumentu. Przeanalizuj mikro macierze wirusowe chipp za pomocą analizy skupień lub zautomatyzowanego programu analizy chipp RO o nazwie unpredic. Przy użyciu mikro macierzy Viro Chipp nowa wersja wirusa grypy H1N1 z 2009 roku jest łatwo wykrywana w próbce wymazu z nosa pobranej od dziecka z objawami grypopodobnymi.

Ponadto wykazaliśmy, że chip wirusowy jest w stanie zidentyfikować nie tylko wirusy oddechowe, ale także szeroki zakres wirusów pochodzących z różnych tkanek i płynów ustrojowych. Poniżej przedstawiono kilka przykładów wykrywania wirusów w krwi pełnej i surowicy przy użyciu vichi. Są to wyniki odpowiadające mikromacierzy viro chip z próbek krwi – krwi pełnej lub surowicy pobranej od czterech pacjentów dla każdej próbki; przedstawiono dwie najwyższe prognozy wirusowe, przy czym najwyższa prognoza posiada najniższą wartość P.

Na przykład w próbce zaznaczonej na jasnoniebiesko najwyższą przewidywaną wartością jest wirus dengi typu pierwszego. Choć drugie w rankingu przewidywanie wskazuje na wirusa dengi typu drugiego, w tej próbce krwi pełnej faktycznie potwierdzono obecność wirusa dengi typu pierwszego, co jest zgodne z wynikami dict. Kolejnym zastosowaniem mikroarray viro chip jest wykrywanie nowych patogenów.

Przykłady obejmują odkrycia koronawirusa sars X-M-R-V-A, retrowirusa OME powiązanego z rakiem prostaty i zespołem chronicznego zmęczenia u ludzi oraz HTCV, nowego ludzkiego wirusa sercowego związanego z infekcjami dróg oddechowych i biegunką u dzieci. Po opanowaniu ta technika może zostać wykonana w 12 godzin, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procesu. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zapewnienie dostępności całego niezbędnego sprzętu i odczynników zgodnie z poniższym opisem.

W celu potwierdzenia i dalszej analizy nietypowych wzorów hybrydyzacji na chipie wirusowym lub wyników sugerujących obecność nowego wirusa można zastosować inne metody, takie jak specyficzna amplifikacja PCR wirusowa oraz sekwencjonowanie głębokie. Opracowanie tej techniki otworzyło przed badaczami w dziedzinie onkologii możliwość eksploracji powiązań między nowymi wirusami a nowotworami, a w obszarach obrony biologicznej i mikrobiologii klinicznej pozwoliło na opracowanie skondensowanych testów opartych na mikromacierzach do szybkiej diagnostyki patogenów, natomiast w wirologii umożliwiło charakterystykę nowych wirusów oraz ich związku z chorobami. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykonywania wszystkich etapów analizy z wykorzystaniem mikromacierzy wirusowej — szeroko zakrojonego testu nadzorczego do wykrywania patogenów wirusowych w próbkach klinicznych — począwszy od ekstrakcji kwasów nukleinowych z próbek klinicznych, aż po hybrydyzację na mikromacierzy i analizę wyników.

Należy pamiętać, że praca z próbkami klinicznymi jest uznawana za materiał biologicznie niebezpieczny, a ekstrakcja kwasów nukleinowych powinna być przeprowadzana w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego dwa lub wyższym.