Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie nowej i szybkiej metody amplifikacji sygnału do detekcji i charakterystyzacji podtypów wirusa grypy na platformie chipa grypowego, będącej mikromacierzą o niskiej gęstości. Osiąga się to poprzez włączenie biotynilowanych DTP oraz zastosowanie starterów z końcem fosforanowym na pozycji 5' w celu amplifikacji segmentu genu macierzy oraz segmentu genu niestrukturalnego z ekstraktów RNA wirusa grypy. Po reakcji PCR następuje trawienie enzymatyczne i fragmentacja w celu wytworzenia krótkich, jednoniciowych, biotynilowanych i amplifikowanych produktów wirusowych, które następnie są hybrydyzowane z macierzą po przeprowadzeniu hybrydyzacji.

Detekcja typu Fox wykorzystuje fotopolimeryzację do tworzenia dużych plamek polimerowych, w których zachodzi hybrydyzacja, a różnicowe wzory hybrydyzacji służą do wykrywania podtypów wirusa grypy. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak standardowa detekcja fluorescencyjna, jest jej stosunkowo niski koszt oraz szybki wynik widoczny gołym okiem, przy zachowaniu czułości analitycznej zbliżonej do fluorescencji. Metoda ta, dzięki swojej uniwersalności, pozwala na charakterystykę wirusów grypy z wykorzystaniem tzw. flu chip.

Metodę Ampl Fox można zastosować również w wielu innych układach, takich jak inne mikromacierze o niskiej gęstości oparte na DNA i białkach. W teorii każdy produkt biotynilowany powinien być wykrywalny przy użyciu amox. Procedurę zaprezentują Amber Taylor, naukowiec współpracujący, oraz Kevin Moulton, asystent badawczy w Endeavor, którzy w ciągu ostatnich kilku lat odgrywali kluczową rolę w opracowaniu instrumentu Fox oraz chemii detekcyjnej.

Wyizoluj viralne RNA z 200 µL izolatu wirusa, używając zestawu do ekstrakcji viralnego RNA zgodnie z protokołem producenta. Eluuj końcową objętość 60 µL i przechowuj ekstrakty w temperaturze -70 °C lub niższej do późniejszego użycia. Następnie przygotuj master mix do RT-PCR w warunkach chłodzenia (na lodzie) zgodnie z protokołem producenta.

Używając mieszaniny BIOTYNYLOWANYCH dNTP, należy dodać do master mixu mieszaninę starterów do chipa flu w stężeniach przedstawionych na rysunku. Jeden starter z każdego zestawu powinien posiadać grupę fosforanową na końcu 5', aby ułatwić trawienie enzymatyczne. Zestaw starterów flu A generuje produkt o długości 1032 par zasad, a zestaw starterów flu B generuje produkt o długości 811 par zasad.

Krótko wymieszać na wirówce typu vortex i rozdzielić 18 µL master mixu do cienkościennych probówek PCR. Następnie dodać 2 µL matrycy RNA do każdej probówki z reakcją. Przenieść probówki PCR do termocyklera i zastosować profil cykliczny z odpowiednią temperaturą przyłączania.

Profil cykli zastosowany w tym teście przedstawiono tutaj. Przygotować mieszaninę do trawienia enzymatycznego, łącząc 2,2 µL buforu do reakcji enzymatycznej, 0,8 µL wody wolnej od nukleaz oraz 1,0 µL enzymu lambda egzonukleazy na jedną reakcję PCR. Wyjąć próbki z termocyklera i dodać cztery mikrolitry do każdej probówki PCR.

Włóż próbki z powrotem do termocyklera i zaprogramuj urządzenie zgodnie z instrukcją na 37°C przez 15 minut, a następnie na 95°C przez 10 minut. Następnie umieść jednorazowe studzienki do hybrydyzacji wokół mikromacierzy przeznaczonych do hybrydyzacji. Po tym przemyj preparaty w 110 ml oczyszczonej wody na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut.

Osusz slajdy, delikatnie dotykając krawędzi dołka chusteczką. Połącz 22 µL dwukrotnego buforu do hybrydyzacji z każdym z produktów fragmentowanych jednoniciowych DNA, krótko wymieszaj i nanieś 40 µL do dołków macierzy mikroarray. Pozostaw slajdy do hybrydyzacji na jedną godzinę w komorze wilgotnościowej; po hybrydyzacji wyjmij slajdy z komory i krótko przepłucz każdy z nich 2 mL buforu płuczącego D. Umieść slajdy w statywie.

Następnie, używając wytrząsarki orbitalnej, wlej 110 mililitrów buforów piorących A i B do oddzielnych pojemników. Myj kasetkę z preparatami w buforze A przy prędkości od 60 do 90 RPM (prędkość ta będzie stosowana we wszystkich kolejnych etapach płukania) przez jedną minutę. Następnie wyjmij kasetkę z buforu piorącego A i krótko opłucz ją buforem piorącym D. Przenieś kasetkę do buforu piorącego B i myj na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut.

Po przemyciu delikatnie osusz macierze na każdym preparacie za pomocą chusteczki i umieść wysuszone preparaty w komorze wilgotnościowej. W ramach przygotowania do etapów kolorymetrycznego wykrywania FOX, połącz 10 µL amplitudy, 20 µL buforu amplitudy 2x oraz 10 µL oczyszczonej wody dla każdej macierzy przeznaczonej do obróbki; przenieś 40 µL mieszaniny znakującej na każdą macierz i pozwól reakcji znakowania przebiegać w zamkniętej komorze wilgotnościowej przez pięć minut. W trakcie hybrydyzacji przygotuj 110 ml buforu płuczącego C w pojemniku. Po znakowaniu natychmiast wypłucz każdą macierz buforem płuczącym D. Umieść każdy preparat w statywie i płucz w buforze C na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut; po płukaniu buforem C zanurz krótko statyw z preparatami trzy razy w pojemniku z oczyszczoną wodą.

Aby usunąć pozostałości soli, należy wysuszyć macierze zgodnie z wcześniej opisaną procedurą. Przechowywać macierze w ciemnej kasecie do momentu fotoaktywacji i obrazowania, które powinny zostać przeprowadzone w ciągu 24 h. Następnie włączyć czytnik Amli Fox i upewnić się, że oprogramowanie Amli view jest gotowe do fotoaktywacji przed wykryciem próbki z macierzy.

Najpierw należy wyznaczyć optymalny czas fotoaktywacji dla wszystkich próbek, przeprowadzając krótką procedurę kalibracyjną. Raz dziennie przed użyciem należy ogrzać roztwór Amplify do temperatury pokojowej i krótko wymieszać go za pomocą wortexa, następnie pipetować 3 µL wzmacniacza Amplify do fiolki z roztworem Amplify i dokładnie wymieszać. Przez 10 sekund należy równomiernie nanieść 40 µL roztworu Amplify na tylko jedno szkiełko naraz, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza.

Włóż szkiełko z mikromacierzą do komory fotoaktywacji czytnika Amplify. Rozpocznij fotoaktywację, wybierając opcję „start” w oprogramowaniu PL view, stosując czas fotoaktywacji ustalony podczas procesu kalibracji. Po zakończeniu procesu przepłucz mikromacierz dwiema mililitrami oczyszczonej wody, aby usunąć nadmiar polimeru amplify clear; formowanie polimeru nastąpiło teraz w plamkach zawierających docelowe DNA, co zapewnia lepszą wizualizację.

Po barwieniu pozostaw plamki polimerowe do wyschnięcia na dwie minuty. Następnie nanieś dwie krople barwnika amply red na macierz i pozwól, aby barwienie trwało przez dwie minuty. Po barwieniu szybko opłucz preparat wodą oczyszczoną i wysusz w sposób opisany wcześniej, a następnie umieść preparat w komorze obrazowania czytnika Amli Fox, aby zebrać obraz i przetworzyć wyniki za pomocą oprogramowania amli. Lewy obraz przedstawia detekcję nowej próbki H1N1 z 2009 roku za pomocą Amli Fox.

Podczas gdy obraz po prawej stronie wykorzystuje tradycyjną fluorescencję generowaną przez konfokalny skaner mikroarray fluorescencyjnych, ten sam ogólny wzór detekcji jest łatwo widoczny dla obu metod. Jednak wynik Amli fox jest widoczny gołym okiem. Obrazy te przedstawiają wyniki z chipów fluorescencyjnych pochodzenia ludzkiego, H3N2 pochodzenia ludzkiego, H1N1 pochodzenia świńskiego oraz negatywny array z lisa, w którym nie wykryto grypy.

Sekwencje A dwa i trzy zaznaczone na niebiesko generują sygnał dla wszystkich pokazanych podtypów grypy, natomiast sekwencje zaznaczone na czerwono w prawym dolnym rogu generują sygnał wyłącznie dla próbki H1N1 pochodzenia świńskiego. Próbka negatywna wykazuje sygnał dla sekwencji kontroli wewnętrznej zaznaczonej na zielono, co wskazuje na brak inhibicji lub błędu w reakcji RT-PCR.

Po opanowaniu całego procesu, od ekstrakcji z fiolki, przez wykrywanie amoksycyliny, aż po końcową interpretację wyników, można go przeprowadzić w ciągu około sześciu godzin. Część procedury dotycząca detekcji Ampl Fox, wliczając kalibrację urządzenia, może zostać zrealizowana w około 30 minut po zastosowaniu tej procedury. W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania można zastosować inne metody, takie jak częściowe lub pełne sekwencjonowanie genomu.

Niniejszy test grypy jest przeznaczony do wstępnego przesiewu, w szczególności w przypadku próbek, które wykazują unikalny wzór hybrydyzacji. Ponieważ metoda detekcji ma charakter ogólny, mamy nadzieję, że badacze znajdą nowe i interesujące zastosowania dla mikromacierzy o niskiej gęstości, w których ta metoda detekcji mogłaby przynieść dodatkową wartość.