Separacja kulek i komórek w wielokanałowych urządzeniach mikroprzepływowych z wykorzystaniem dielektroforezy i przepływu laminarnego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest manipulowanie komórkami i koralikami w urządzeniach mikrofluidycznych za pomocą dielektroforezy (DEP) z wykorzystaniem obwodów drukowanych (PCB). Cel ten osiąga się poprzez zaprojektowanie i przygotowanie elektrod PCB oraz kanałów mikrofluidycznych. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie zestawu mikrofluidycznego PCB oraz roztworów koralików i komórek.

Trzecim krokiem procedury jest wypełnienie kanałów medium o niskiej przewodności, a następnie wprowadzenie kulek i komórek. Ostatnim etapem procedury jest podłączenie zestawu PCB do wzmacniacza mocy i generatora funkcji, a następnie zainicjowanie DEP. W rezultacie można uzyskać wyniki obrazujące separację i manipulację komórkami oraz kulkami w urządzeniach mikrofluidycznych z wykorzystaniem DEP.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ użytkownik musi zrozumieć zasady DEP, aby opracować efektywną elektrodę współpracującą z urządzeniem mikroprzepływowym w celu manipulacji pożąganymi komórkami lub kuleczkami. Z drugiej strony, zastosowanie płytek PCB jako elektrod sprawia, że aktywacja komórek i kuleczek w urządzeniach mikroprzepływowych staje się dostępna dla szerokiego zakresu dyscyplin naukowych. Pierwszym krokiem tej procedury jest zaprojektowanie elektrod na płytce drukowanej (PCB) o geometrii pozwalającej na wytworzenie niejednorodnego pola elektrycznego.

Po zakończeniu projektowania należy zamówić spersonalizowane układy elektrod PCB w komercyjnej firmie produkcyjnej. Po otrzymaniu wykonanej na zamówienie płytki PCB, należy ją otworzyć i poddać inspekcji na potrzeby niniejszego pokazu. Płytka PCB ma długość 8,4 cm i szerokość 2,1 cm.

Elektrody metalowe mają pięć milimetrów szerokości. W tym przykładzie elektrody składają się z dwóch długich metalowych pasków oraz dwóch obszarów poprzecznych o długości 4,5 milimetra, w których elektrody są rozmieszczone w układzie grzebieniowym. Te obszary grzebieniowe generują silne niejednorodne pole elektryczne, aby utworzyć połączenie między stymulatorem a elektrodą na PCB.

Umieść drut o rozmiarze 16 gauge na końcówce elektrody. Używając rozgrzanej lutownicy, przymocuj drut do metalowego obszaru PCB. Powoduje to rozgrzanie drutu.

Przyłóż spoiwo do rozgrzanego drutu i pozwól, aby niewielka ilość spoiwa wpłynęła w drut. Po wypełnieniu drutu spoiwem, usuń lutownicę, przytrzymując drut w miejscu do czasu ostygnięcia spoiwa. Powtórz proces lutowania dla drugiego połączenia elektrycznego na płytce PCB.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie kanałów mikroprzepływowych o pożądanym wzorze rozgałęzień. Wykorzystując standardowe techniki mikrotworzenia, należy stworzyć formę matryczną do zdefiniowania kanałów, używając wafla krzemowego i fotorezystu SU-8. Forma matryczna ta posiada jeden kanał wlotowy i trzy kanały docelowe.

Szerokość kanałów wynosi 100 µm, a wysokość kanałów 27 µm. Po przygotowaniu formy matki wymieszać elastomer polidimetylosiloksanu (PDMS) z utwardzaczem w stosunku wagowym 10:1 i odstawić na pięć minut. Wlać ciekły PDMS na wcześniej przygotowaną formę matkę z SU-8 i usunąć pęcherzyki powietrza, poddając ciekły PDMS działaniu próżni przez trzy minuty.

W razie potrzeby powtórz proces próżniowy, aby całkowicie usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza. Do usunięcia nadmiaru pęcherzyków można wykorzystać strumień azotu. Utwardź PDMS w piekarniku w temperaturze 70 °C przez dwie godziny.

Za pomocą żyletki oddziel warstwę P-D-M-S-S z kanałami mikrofluidycznymi od płytki krzemowej. Należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić płytki, trzymając ją przestrzenią kanałów do góry. Użyj wycinaka do biopsji, aby wykonać otwory umożliwiające wprowadzanie płynów i komórek do urządzenia mikrofluidycznego. Przytnij krawędzie.

Usuń nadmiar PDMS. Sprawdź urządzenie mikrofluidyczne, aby upewnić się, że jest wolne od kurzu i zanieczyszczeń. Do oczyszczenia PDMS użyj taśmy 3M Scotch Magic.

Naraź kanały PDMS oraz czyste szkiełko podstawowe o grubości od 80 do 130 µm na działanie gazu plazmowego przez 1,5 minuty. Wyjmij płytkę PDMS i szkiełko podstawowe z urządzenia do czyszczenia plazmowego do szalki Petriego, dociśnij kanały mikrofluidyczne PDMS do szkiełka podstawowego, a następnie podgrzewaj cały zestaw mikrofluidyczny na płycie grzejnej ustawionej na 100 °C przez co najmniej 15 minut. Ostatnim etapem przygotowania urządzenia mikrofluidycznego jest ustawienie kanałów PDMS i szkiełka podstawowego nad elektrodami płytki PCB.

Zacznij od naniosienia około 10 µL oleju mineralnego na PCB. Aby zapewnić szczelny kontakt między PCB a szkiełkiem nakrywką, umieść zespół kanału mikroprzepływowego ze szkiełkiem nakrywką na zaolejonym PCB. Dociskając delikatnie zespół mikroprzepływowy do oleju, upewnij się, że kontakt jest prawidłowy, aby zminimalizować liczbę pęcherzyków powietrza, które mogą utrudniać wizualizację komórek i kulek.

Kolejnym ważnym krokiem jest przygotowanie mieszaniny mediów o niskiej przewodności, składającej się z 8,5% sacharozy i 0,3% glukozy (stosunek masy do objętości) w wodzie dejonizowanej. Urządzenie mikrofluidyczne jest teraz gotowe do użycia; za pomocą pipety należy wypełnić każdy kanał mikrofluidyczny od 15 do 20 µL mediów o niskiej przewodności, jeśli jest to konieczne. W celu usunięcia pęcherzyków powietrza z kanałów należy zastosować aspirację próżniową.

Kolejnym krokiem jest wprowadzenie cząstek testowych do urządzenia mikroprzepływowego. W tej demonstracji wykorzystuje się zawiesinę 550 kuleczek polistyrenowych na mikrolitr medium o niskiej przewodności; ponieważ kuleczki mogą z czasem osiadać, należy je ponownie zawiesić poprzez wymieszanie. Następnie, używając pipety, należy wprowadzić 200 µL zawiesiny kuleczek polistyrenowych do kanału.

Kolejnym krokiem jest przygotowanie elektrod oraz podłączenie wyjścia generatora funkcji do wejścia wzmacniacza mocy AC. Następnie należy podłączyć wyjście wzmacniacza do przewodów elektrod. Wszystkie przewody elektryczne i powierzchnie układu należy okleić taśmą izolacyjną, aby chronić użytkowników przed ryzykiem porażenia prądem.

Ustaw generator funkcji tak, aby generował sygnał sinusoidalny o częstotliwości od 1 do 1,5 MHz. Uruchom DEP, aby rozpocząć sortowanie komórek i kulek w tej konfiguracji. Kanał wlotowy znajduje się po prawej stronie, a trzy kanały docelowe rozdzielają się w punkcie trifurkacji.

Elektrody PCB odpowiadają czarnym paskom bez przepływu laminarnego i bez DEP. Po uruchomieniu DEP koraliki pozostają w zasadzie nieruchome, jednak przy braku przepływu. Kiedy przepływ laminarny jest włączony, koraliki migrują w kierunku elektrod PCB i oddalają się od przestrzeni między elektrodami.

Kiedy DEP jest wyłączone, kulek płynących przez kanały wlotowe dzielą się pomiędzy trzy kanały docelowe. Po uruchomieniu DEP, przy zachowaniu przepływu laminarnego, kuleczki są kierowane tak, aby płynęły wyłącznie w kanale środkowym. Na kolejnych filmach urządzenie mikrofluidyczne zostało obrócone nad elektrodami PCB, co spowodowało zmianę orientacji kanałów.

W odniesieniu do elektrod PCB. Kanał wlotowy, który wcześniej był prostopadły do elektrod PCB, jest teraz niemal równoległy do elektrod przy włączonym przepływie laminarnym. Jednak przy wyłączonej DEP kule wchodzą do wszystkich trzech kanałów docelowych w równym stopniu.

Po uruchomieniu DEP koraliki zbliżają się do punktu trifurkacji, a siła DEP wciąga je do kanału bocznego znajdującego się nad elektrodą. Kolejny zestaw rycin w wideo przedstawia mieszaninę ludzkich komórek gruczolakoraka okrężnicy (HT 29) oraz fluorescencyjnych koralików w urządzeniu mikroprzepływowym. Na tym obrazie DIC otwarta strzałka wskazuje kierunek przepływu laminarnego, a kanały zostały zaznaczone liniami przerywanymi.

Odbijające światło elektrody metalowe są widoczne jako jasny pasek w tle; do obrazowania kulek wykorzystano mikroskopię DIC. Intensywność skali. Obrazy posłużyły do zwiększenia widoczności komórek.

Rysunek ten jest tym samym obrazem co poprzedni, jednak przedstawionym w skali intensywności glow, co pozwala na wizualizację zarówno komórek, jak i kulek. Odblaskowe elektrody metalowe widoczne są na tym rysunku jako żółte i zielone pasy. Przy zastosowaniu DEP kulki opuszczają prawy kanał, jak pokazano na obrazie DIC, podczas gdy komórki HT 29 opuszczają kanał środkowy i lewy, co widać na obrazie w skali glow przed uruchomieniem DEP. Mieszanina komórek i kulek przepływa z jednego kanału wlotowego do trzech oddzielnych kanałów docelowych.

Po wywołaniu DEP, kuleczki i komórki są selektywnie przemieszczane do oddzielnych kanałów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak rozpocząć wdrażanie dielektroforezy w celu manipulowania komórkami i kuleczkami w urządzeniach mikroprzepływowych.