Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Ogólnym celem poniższej metody jest obrazowanie zachowania pojedynczych komórek różnych szczepów drożdży w tych samych warunkach dynamicznych. Osiąga się to poprzez wykonanie dwuwarstwowego urządzenia mikrofluidycznego, w którym warstwa dolna zawiera poszczególne szczepy oddzielnie, a warstwa górna w drugim kroku zapewnia dynamiczne warunki przepływu. Różne szczepy drożdży umieszcza się w studzienkach, a następnie zamyka urządzenie, tworząc pojedynczy kanał z wieloma odseparowanymi szczepami.

W następnym kroku obrazujemy reakcje komórek na dynamiczne zmiany w pożywce. Dzięki kontrolowaniu szybkości przepływu w dwóch wlotach kanału Y, wyniki ukazują różne szczepy poddane tym samym warunkom dynamicznym, bez zanieczyszczeń krzyżowych między studzienkami. To urządzenie mikrofluidyczne posiada kilka kluczowych zalet w porównaniu z innymi istniejącymi systemami. Pozwala ono na obrazowanie wielu odrębnych szczepów w tych samych warunkach dynamicznych.

Co więcej, niezwykle istotne jest to, że można go łatwo wykonać w każdym laboratorium bez potrzeby posiadania specjalistycznego sprzętu. Metoda ta powstała w wyniku dyskusji nad sposobem monitorowania odpowiedzi różnych dzikich izolatów z Azji Wschodniej na przejścia głodowe. Na początek należy narysować lub wydrukować w odpowiedniej skali pożądany układ mikrokanałów.

Następnie pokryj szkiełko przedmiotowe warstwami taśmy klejącej. Aby uzyskać pożądaną wysokość kanału, połóż projekt układu na płaskiej powierzchni i wyrównaj szkiełko względem wzoru projektu. Teraz ostrożnie wytnij taśmę na szkiełku przedmiotowym zgodnie z układem. Usuń taśmę klejącą ze wszystkich obszarów szkiełka przedmiotowego.

Przyjmij te w układzie mikrokanału. Umieść szkiełko w piecu grzewczym w temperaturze 65 °C na trzy minuty. Następnie delikatnie oczyść etanolem.

Zmieszać bazę i utwardzacz PDMS zgodnie z zaleceniami producenta. Wlać około 30 ml mieszaniny PDMS do szalki Petriego, aby uzyskać wysokość około 0,5 cm. W razie potrzeby odgazować PDMS w próżni.

Zanurz szkiełko przedmiotowe w PDMS, tak aby wzór z taśmy klejącej był skierowany ku górze. Umieszczenie wzoru po nalaniu PDMS zapobiega tworzeniu się pęcherzyków powietrza między szkiełkiem a dnem naczynia. W nowej szalce Petriego o średnicy 90 mm wlej 3 mL mieszaniny PDMS. Utwardzaj przez 48 h w temperaturze 65 °C, upewniając się za pomocą poziomicy, że szalka znajduje się w pozycji poziomej.

Ten krok można wykonać za pomocą kodera wirnikowego, jeśli jest dostępny. Przeprowadzić procesy DGA i utwardzanie zgodnie z wcześniejszymi instrukcjami. Następnie ostrożnie wyciąć warstwę przepływową urządzenia mikroprzepływowego do pożądanego rozmiaru, używając wycinaka do biopsji.

Wykonaj otwory dla wlotów i wylotów w warstwie przepływowej. Wytnij również warstwę otworów o podobnej wielkości z drugiej szalki Petriego i umieść ją na grubym szkle. Nasuń na to projekt układu.

Następnie należy wybić otwory w miejscach odpowiadających mikrokanałom na schemacie, używając etanolu, oczyścić obie warstwy PDMS oraz szklaną lamkę i wysuszyć je na powietrzu. W kolejnym kroku należy poddać szklaną lamkę oraz warstwę PDMS z otworami działaniu standardowej plazmy trawiącej w przypadku wiązania nieodwracalnego lub przenośnego urządzenia do traktowania koronowego w przypadku wiązania odwracalnego. Należy ostrożnie umieścić warstwę z otworami na szklanej lamce, aby uzyskać adhezję.

Delikatnie usuń pęcherzyki powietrza. Przygotuj odpowiednie pożywki w odpowiednich strzykawkach i podłącz je do rurek typu tigon przeprowadzonych przez pompę strzykawkową. Do obrazowania komórek.

Wykorzystać odpowiednie stężenia. Przejść do pożądanej fazy, dokładnie wymieszać kulturę w wirówce Vortex i przenieść 300 µL do probówek do mikrowirówki. Delikatnie nanieść 1 µL con canna A do każdej studni warstwy studni PDMS.

Wypłucz nadmiar konkanawoliny A z każdej dołki dwukrotnie, delikatnie pipetując wodę, podczas gdy konkanawolina A wysycha. Przemyj szczepy dwukrotnie 300 µL pożywki SC pozbawionej glukozy. Usunięcie resztek glukozy ze ścian komórkowych sprzyja właściwej adhezji do konkanawoliny.

Po wirowaniu w vortexie, należy dokładnie pipetować około 0,5 µL zawiesiny komórkowej do poszczególnych dołków. Pozostałe komórki należy delikatnie wypłukać pożywką bogatą. Kolejne dwa kroki muszą zostać wykonane szybko, aby zapobiec wysychaniu komórek.

W ramach opcjonalnego kroku poddaj chip oraz studzienki obróbce plazmą, uważając, aby nie kierować strumienia bezpośrednio do wnętrza studzienek. Następnie, korzystając ze stereomikroskopu, ostrożnie nałóż chip na studzienki, zwracając szczególną uwagę na ich wzajemne wyrównanie. Delikatnie dociśnij, aby połączyć obie warstwy PDMS.

Powoli wypełnij urządzenie całkowicie około 50 µL pożywki bogatej, upewniając się, że w kanale nie pozostały pęcherzyki powietrza. Następnie podłącz urządzenie, wkładając rurki do odpowiednich wlotów i uruchom przepływ pożywki. Dopilnuj, aby w rurkach nie powstały pęcherzyki powietrza, ponieważ mogą one utknąć w urządzeniu i zakłócić przepływ.

Następnie należy umieścić urządzenie pod mikroskopem i znaleźć w każdym z nich odpowiednie punkty obrazowania. Komórki w dołkach należy utrzymywać w przepływie bogatej pożywki przez jedną godzinę lub dłużej, jeśli jest to konieczne, aby umożliwić ich regenerację.

Rozpocznij eksperyment przy ustawieniu stałego przepływu. Ustaw pompę A na 0,8 ml/h, a pompę B na 0,2 ml/h. W przypadku medium przepływ powinien obejmować ponad 80% szerokości kanału.

Możemy dynamicznie zmieniać warunki w urządzeniu poprzez zmianę względnych szybkości przepływu. Nowe warunki stabilizują się w ciągu kilku sekund wzdłuż całego kanału. Aby zademonstrować separację między różnymi szczepami, wykonano obrazowanie dwóch rozróżnialnych szczepów drożdży w naprzemiennych studzienkach.

Należy zauważyć, że w tym eksperymencie nie dochodzi do przemieszczania się komórek między dołkami. Oba szczepy posiadają czynnik transkrypcyjny MSN2 znakowany YFP, aby zbadać jednoczesny efekt dynamicznie zmieniających się warunków. Prędkości przepływu w dwóch kanałach wlotowych zostały zmienione w celu utworzenia skoku medium bez glukozy.

Doprowadziło to do lokalizacji MSN two w jądrze komórkowym. Co istotne, można analizować przebieg czasowy poziomów YFP w jądrowych MSN two w pojedynczych komórkach. Zatem mikrofluidyczne urządzenie PDMS może być wykorzystywane do stosowania jednoczesnych warunków dynamicznych w wielu dołkach.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek podczas montażu urządzenia. Po opanowaniu tej techniki można ją łatwo stosować bez konieczności wykorzystywania miękkiej litografii.