Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zapoznanie studentów nauk przyrodniczych z technologią mikromacierzy poprzez badanie różnic w ekspresji genów u drożdży poddanych stresowi oksydacyjnemu. Cel ten realizowany jest poprzez wstępną izolację całkowitego RNA z kultur drożdży traktowanych nadtlenkiem wodoru oraz z nie traktowanych kontroli. Drugim krokiem procedury jest synteza i oczyszczanie cDNA z tych próbek RNA.

Następnie cDNA jest wykorzystywane do przygotowania znakowanego biotyną cRNA poprzez transkrypcję in vitro. Ostatnim etapem procedury jest fragmentacja znakowanego biotyną cRNA w celu hybrydyzacji z chipami genowymi drożdży AFI metrics. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące różnice w ekspresji w dwóch próbkach drożdży, a za pomocą bioinformatyki zademonstrować studentom studiów licencjackich możliwości analizy mikromacierzy.

Zespół Outreach sieci Vermont Genetics Network wpadł na pomysł opracowania tej metody, gdy otrzymał zadanie wprowadzenia technologii microray do studentów nauk przyrodniczych w całym stanie Vermont, aby wzbogacić ich edukację naukową. Do tej pory metoda ta została wdrożona w wielu placówkach w ośmiu uczelniach licencjackich w całym stanie. Główną zaletą wykorzystania modułów dydaktycznych microray jest możliwość nauczania grupy osób ogólnych technik biologii molekularnej, które są stosowane każdego dnia w pracy laboratoryjnej.

Możemy również wykorzystać to narzędzie do nauczania zarówno studentów, jak i nauczycieli oraz naszych grup badawczych. W rzeczywistości studenci i profesorowie współpracują razem nad tym samym projektem. Uczą się oni określonych technik wymagających dużej precyzji, takich jak praca z RNA, co nie jest łatwym zadaniem.

Uczą się, jak wytrącać DNA przy użyciu odczynników wizualizacyjnych. Mają możliwość zastosowania technik, z którymi zetkną się podczas studiów magisterskich lub w codziennej pracy w laboratoriach biologii molekularnej. Chociaż metoda ta jest odpowiednia do badania stresu oksydacyjnego u drożdży, można ją z pewnością zastosować w odniesieniu do innych organizmów modelowych i innych systemów biologicznych, które mogą Państwo chcieć zbadać.

Zmiany w ekspresji genów mogą być związane z procesami rozwojowymi, toksynami środowiskowymi, konkretnymi stanami chorobowymi i wieloma innymi czynnikami. Aby zbadać różnice w ekspresji u drożdży poddanych stresowi oksydacyjnemu, w pierwszej kolejności ekstrahuje się całkowite RNA z dwóch kultur drożdży poprzez lizę enzymatyczną. Jedna kultura została poddana stresowi oksydacyjnemu poprzez godzinną inkubację z 0,5 millimolar nadtlenkiem wodoru w soli fizjologicznej Hanksa (HBSS), podczas gdy druga kultura była traktowana wyłącznie HBSS w celu uzyskania kontroli.

W pierwszej kolejności należy opisać dwie probówki do mikrocentrifugowania o pojemności 1,7 ml, wpisując odpowiednie dane identyfikacyjne. Do każdej probówki przenieść 1,5 ml odpowiedniej kultury drożdży. Probówki wirować przy 5 000 G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Po wirowaniu za pomocą mikropipety ostrożnie usuń i odrzuć nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przed kontynuowaniem procedury sprawdź, czy osad jest wystarczająco duży. Jeśli osad jest zbyt mały, dodaj 1,5 milliliters kultury do tej samej probówki zawierającej osad, a następnie odwiruj próbkę, aby uzyskać większy osad.

Usunąć nadsącz za pomocą mikropipety, usuwając jak największą ilość cieczy z osadu drożdży. Następnie do osadu drożdży dodać 100 µL buforu SG oraz 30 µL roztworu liazy i wymieszać na wortexie. Inkubować obie probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Delikatnie zakręcaj każdą probówką co 10 minut, aby wygenerować sferoplasty. Jednym z najbardziej krytycznych kroków podczas wysiewu sferoplastów drożdży jest upewnienie się, że po traktowaniu faktycznie powstały w stu procentach sferoplasty. Oznacza to, że nie wszystkie enzymy lityczne są jednakowej jakości.

Należy sprawdzić, czy zastosowany enzym lityczny zapewnia prawidłowe tworzenie sferoplastów. W tym celu należy przenieść próbki na szkiełko przedmiotowe i poddać je obserwacji mikroskopowej po dodaniu 0,1% SDS, aby potwierdzić formowanie się protoplastów. Aby zaobserwować całkowite tworzenie sferoplastów, należy nanieść 10 µL próbki drożdży na szkiełko przedmiotowe, a następnie podczas obserwacji mikroskopowej dodać 1 µL 0,1% SDS, co spowoduje pęcznienie komórek drożdży i formowanie idealnych sfer lub sferoidów. Ważne jest, aby zaobserwować, że komórki pączkujące również tworzą sferoidy.

W przypadku zaobserwowania częściowego osadzania się sferoidów zaleca się przedłużenie inkubacji z liazą. Po potwierdzeniu całkowitego osadzenia sferoidów przy zastosowaniu 350 µL buforu BRLT do każdej probówki, należy dodać 250 µL 100% etanolu. Należy upewnić się, że probówka jest szczelnie zamknięta, mocno trzymając pokrywkę i energicznie mieszając na wirówce typu vortex przez jedną minutę.

Niniejsza procedura służy do lizy płytek Sphero. Następnie należy użyć kolumnek wirowych R i easy Z w celu wyizolowania i oczyszczenia RNA z obu kultur. Na koniec należy ocenić jakość wyekstrahowanego RNA, wykorzystując gotowy żel agarozowy 1,2% do elektroforezy, aby przygotować znakowane biotyną cRNA.

Całkowity RNA wyekstrahowany z komórek drożdży jest najpierw wykorzystywany do syntezy cDNA poprzez odwrotną transkrypcję. Po otrzymaniu cDNA należy przygotować probówki z żelem Phase Lock do wytrącenia cDNA; wiruj probówki z żelem Phase Lock z maksymalną prędkością przez jedną minutę, aby upewnić się, że żel znajduje się na dnie probówki. Nie mieszaj probówek z żelem Phase Lock w wirówce typu vortex. Aby wytrącić cDNA, pipetuj 162 µL dolnej warstwy mieszaniny tris-buforowanego fenolo-chloroformu i alkoholu izoamylowego o pH 8,0 (mieszanina PCI) i dodaj do 162 µL zawartości probówki z reakcją syntezy drugiej nici cDNA; w tym kroku wymagane są równe objętości mieszanin wodnej i organicznej.

Wymieszaj zawartość za pomocą wstrząsarki typu vortex przez pięć sekund. Następnie, używając mikropipety, przenieś całą mieszaninę CD N-A-P-C-I do probówki z żelem fazowym (phase lock gel). Nie używaj wstrząsarki typu vortex do probówki z żelem fazowym; odwiruj ją z maksymalną prędkością przez dwie minuty.

Następnie za pomocą mikropipety przenieś górną warstwę z probówki z żelem separacyjnym do nowo oznakowanej probówki o pojemności 1,7 ml. Postaraj się zebrać jak największą ilość tej warstwy. Do probówki wirówkowej 1,7 ml dodaj 405 µL 100% etanolu, 80 µL octanu amonu oraz 1 µL barwnika do osadu i wymieszaj na wortexie.

Krótko umieść probówkę w wirówce, kierując zawias probówki na zewnątrz, i wiruj z maksymalną prędkością przez 20 minut. Po zakończeniu wirowania w temperaturze pokojowej ostrożnie wyjmij probówkę z wirówki, uważając, aby nie naruszyć osadu CD NA. Osad powinien mieć różowy kolor dzięki zastosowanemu barwnikowi i wielkość zbliżoną do ziarnka soli.

Obok probówki, pod zawiasem, umieść pellet CD NA na lodzie i niezwłocznie przystąp do jego oczyszczania. Aby rozpocząć procedurę oczyszczania pelletu CD NA, użyj mikropipety P 1000, aby ostrożnie usunąć z probówki cały nadsącz. Należy uważać, aby nie naruszyć pelletu.

Do probówki dodaj 500 µL zimnego, 80% etanolu do próbki. Delikatnie zakręć probówkę i powoli odwróć ją kilka razy. Uważnie obserwuj osad, aby upewnić się, że nie oddzielił się on od ścianki probówki.

Jeśli osad odklei się od ścianek, można go ponownie osadzić na dnie probówki, umieszczając ją w statywie i pozwalając osadowi opaść na dno lub wirując probówkę z maksymalną prędkością przez 15 sekund. Następnie, używając mikropipety P 1000, należy ostrożnie usunąć etanol, uważając, aby nie naruszyć osadu. Przechyl probówkę, aby umożliwić usunięcie jak największej ilości cieczy.

Dodaj nową porcję zimnego 80% etanolu, zakręć probówkę i powoli odwróć ją kilka razy. Usuń jak najwięcej etanolu za pomocą mikropipety P 1000. Wirowarkuj probówkę z maksymalną prędkością przez pięć sekund.

Następnie za pomocą mikropipety P 10 należy usunąć ostatnie kilka mikrolitrów etanolu, uważając, aby nie naruszyć osadu. Otwartą probówkę umieść w suszarce na 10 do 20 minut, aby odparować pozostały etanol. Po wyschnięciu osad jest łatwy do zgubienia, dlatego należy ostrożnie obchodzić się z probówką i pamiętać o zamknięciu zakrętki.

Po zakończeniu suszenia sprawdź wizualnie, czy wysuszony osad znajduje się w probówce. Na koniec resuspenduj wysuszony osad w 22 µL wody wolnej od RNA i umieść probówkę w lodzie. Tak otrzymane cDNA służy następnie do przygotowania cRNA znakowanego biotyną poprzez transkrypcję in vitro z wykorzystaniem zestawu Enzo BioArray.

Po oczyszczeniu i ilościowym oznaczeniu znakowanego biotyną cRNA, poddaje się go fragmentacji w celu przygotowania tarcz. Po wygenerowaniu cDNA stosuje się standardową metodologię transkrypcji in vitro w celu otrzymania biotynilowanego cRNA. Przed nałożeniem na chip mikromacierzy cRNA musi zostać poddany fragmentacji.

Aby rozpocząć tę procedurę, przenieś ilość CRNA równoważną 5 µg do oznakowanej probówki PCR o pojemności 0,5 ml. Dodaj odpowiednią ilość wody wolnej od RNaz, aby całkowita objętość wyniosła 16 µl, a następnie dodaj do probówki 4 µl buforu do fragmentacji 5x. Całkowita objętość w probówce powinna wynosić 20 µl.

Wymieszać zawartość probówki na wortexie i wirować przez 10 seconds. Następnie inkubować probówkę w temperaturze 94 °C przez 30 minutes. Po inkubacji w termocyklerze umieścić probówkę na lodzie.

Fragmentowany i niefragmentowany CRNA z każdej próbki poddaje się następnie ocenie za pomocą elektroforezy z wykorzystaniem gotowego żelu AROS 1,2%. Po zakończeniu procesu żel jest wizualizowany na transiluminatorze i pobierany jest obraz. Końcowy produkt syntezy jest hybrydyzowany z matrycami genowymi drożdży atric, a reprezentatywne wyniki analizy mikromacierzy przedstawiono tutaj.

Pierwsza rycina przedstawia przykład zeskanowanego obrazu z macierzy genów atrics drożdży, wygenerowanego przez oprogramowanie sterujące macierzą genów atrics. Jest to dwuwymiarowy wykres rozrzutu wszystkich transkryptów genetycznych, obejmujący około 6 700 genów, porównujący dane z grupy kontrolnej i traktowanej drożdże. Każdy punkt reprezentuje pojedynczy gen.

Geny zaznaczone kolorem fioletowym wskazują na geny o różnej ekspresji, natomiast geny zaznaczone na czerwono nie wykazują takiej różnicy. W tym przykładzie większość genów o różnej ekspresji to geny zaangażowane w kontrolę cyklu komórkowego, co wynika z ich opisów. Ten schemat blokowy z bazy danych do wizualizacji adnotacji i zintegrowanego odkrywania ilustruje geny o różnej ekspresji w dotkniętej ścieżce biologicznej.

Geny oznaczone czerwoną gwiazdką wskazują geny o obniżonej ekspresji w szlaku mitotycznym. Na koniec przedstawiono reprezentatywne wyniki wykresu wulkanicznego (volcano plot) wygenerowanego przy użyciu oprogramowania geo species gene sifter. Próbki kontrolne i traktowane porównano przy zastosowaniu progu istotności P-value 0,05 oraz progu zmiany ekspresji 1,5-krotnej.

Zdecydowaliśmy się na wykorzystanie drożdży, ponieważ łatwo je szybko hodować, ale zdaliśmy sobie sprawę, że najbardziej krytycznym elementem pracy z drożdżami jest w rzeczywistości przygotowanie odpowiedniego wysiewu sferoplastów. Jednym z aspektów, których chcemy uniknąć w mikrotablicach, jest przeprowadzenie niepełnego trawienia i uzyskanie sferoplastów pochodzących wyłącznie z komórek w fazie G1 lub G2/M. W takim przypadku eksperyment z mikrotablicami byłby przeprowadzany na drożdżach znajdujących się w określonej fazie replikacji.

Kolejnym skomplikowanym zagadnieniem, które staramy się przybliżyć w tym ćwiczeniu, jest wirowanie DNA w celu otrzymania osadu – proces ten jest często omawiany, ale niekoniecznie jest łatwy do przeprowadzenia. W naszym module zastosowaliśmy specjalistyczne probówki oraz odczynniki do wizualizacji, dzięki czemu możliwe jest odwirowanie DNA i bezpośrednia obserwacja osadu, co ułatwia naukę zarówno studentom, jak i nauczycielom.

Dzięki temu może on być wykorzystywany we wszystkich etapach pracy z DNA i RNA po jego opracowaniu. Moduł ten utorował drogę kadrze naukowo-dydaktycznej w instytutach licencjackich do dalszych poszukiwań, potencjalnie w zakresie innych organizmów modelowych lub innych schematów terapeutycznych, które mogłyby być zgodne z istniejącymi programami nauczania lub ich własnymi zainteresowaniami badawczymi. Aby podać przykład niektórych wprowadzonych modyfikacji: jeden ośrodek analizował wpływ działania herbicydu na drożdże, inny badał wpływ leczenia LAMP IDE u drożdży, podczas gdy jeszcze inny skupił się na zmianach rozwojowych w linii komórkowej ssaków, która była dla nich szczególnie interesująca.

I na koniec, inny ośrodek zbadał wpływ różnych źródeł światła na rośliny arabidopsis. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak zorganizować eksperyment z wykorzystaniem mikromacierzy ze studentami nauk przyrodniczych, w tym izolację całkowitego RNA z drożdży, generowanie cDNA oraz fragmentację znakowanego biotyną cRNA. Praktyczne doświadczenia z tak zaawansowanymi technologiami pomagają utrwalić i wzmocnić edukację naukową na poziomie studiów licencjackich.