Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego do kompartymentacji somy i aksonów neuronów

Witamy w laboratorium dr. Newly’ego Johna. Laboratorium Johna specjalizuje się w projektowaniu mikrofluidycznych platform do zastosowań biologicznych. W tym filmie zaprezentujemy proces wytwarzania i wykorzystania urządzenia mikrofluidycznego zaprojektowanego do kompartymentacji i hodowli pierwotnych neuronów.

Urządzenie do badania neuronów zostało po raz pierwszy opisane w czasopiśmie Nature Methods w sierpniu 2005 roku. Od momentu wprowadzenia urządzenie to jest szeroko wykorzystywane przez współpracowników na całym świecie. Urządzenie składa się z fragmentu PDMS odlanego na płytce krzemowej zawierającej wzór SUA urządzenia, który został wcześniej wytworzony metodą fotolitografii.

Urządzenie posiada trzy główne cechy: cztery zbiorniki o średnicy 8 mm, dwa główne kanały o szerokości 1,5 mm, długości 7 mm i wysokości 100 µm oraz mikrowżebienia o szerokości 10 µm i wysokości 3 µm, które łączą oba główne kanały. Długość mikrowżebień może wynosić od 150 µm do 900 µm, choć standardowo wybiera się długość 450 µm. Patrząc na urządzenie tak, aby główne kanały i mikrowżebienia znajdowały się w pionie, można zauważyć, że zbiorniki po lewej stronie wżebień są połączone za pomocą głównych kanałów, podobnie jak zbiorniki po prawej stronie.

Ta cecha umożliwia przepływ cieczy przez główny kanał, co jest istotne, ponieważ pozwala na wprowadzanie komórek i wymianę pożywki. Urządzenie do hodowli neuronów posiada trzy główne zalety w porównaniu z tradycyjnymi platformami do hodowli tkanek. Po pierwsze, umożliwia ono oddzielenie ciał komórkowych (somy) od aksonów. Dzięki zastosowaniu tego urządzenia możliwe jest uzyskanie czystych frakcji aksonalnych.

Rozmiar i długość mikrowgłębień umożliwiają przechodzenie aksonów przez drugi główny kanał, zapobiegając jednocześnie przechodzeniu ciał neuronów. Po drugie, dzięki konstrukcji urządzenia i wykorzystaniu ciśnienia hydrostatycznego, możliwe jest poddanie strony komórkowej lub strony aksonowej urządzenia odrębnym zabiegom poprzez utrzymanie wyższego poziomu cieczy w zbiornikach po jednej stronie urządzenia względem drugiej. Po trzecie, czystą frakcję aksonalną urządzenia można odciąć za pomocą ssania próżniowego, co pozwala badaczowi na analizę i obserwację regeneracji aksonów.

Badaczka Hina Lee zaprezentuje teraz sposób przygotowania mikrofluidycznego urządzenia do hodowli neuronów. Do odlewania formy mikrofluidycznej z polidimetylosiloksanu (PDMS) wykorzystuje się podłoże krzemowe o grubości 3 Ang z wzorem wykonanym z SU-8 metodą fotolitografii. Podłoże krzemowe z wzorem SU-8 nazywamy formami matrycowymi lub po prostu matrycami.

PDMS miesza się z utwardzaczem w stosunku wagowym 10:1. Przykładowo, stosuje się 15 g PDMS na 1,5 g utwardzacza. Następnie PDMS dokładnie miesza się i wlewa na wafle krzemowe.

Wafer krzemowy umieszczony jest w polistyrenowej szalce Petriego o średnicy 10 centymetrów. Do pokrycia MAs warstwą o grubości około czterech milimetrów potrzeba od około 12 gramów do 15 gramów PDMS. Następnie matrycę z PDMS umieszcza się w deskrypatorze próżniowym z otwartą pokrywą szalki Petriego i przykład się próżnię.

Czynność tę wykonuje się, aby pomóc w usunięciu pęcherzyków powietrza z PDMS, które pojawiły się podczas mieszania środka utwardzającego. Usunięcie pęcherzyków powietrza zajmuje około 15 minut. Po 15 minutach przebywania w deskrypatorze próżniowym matrycę z PDMS wyjmuje się z urządzenia.

Na matrycy PDMS wciąż znajduje się kilka pęcherzyków powietrza. Do usunięcia pozostałych pęcherzyków używa się pistoletu powietrznego z filtrem 0,45 mikrona. Następnie matrycę umieszcza się na płycie grzewczej o temperaturze 80 stopni przez jedną godzinę w celu utwardzenia.

Jeśli suszarka próżniowa nie jest dostępna, mieszankę można pozostawić w temperaturze pokojowej przez kilka godzin. Pęcherzyki powietrza z czasem znikną same. W przypadku braku płyty grzewczej PDMS utwardzi się w temperaturze pokojowej po 24 godzinach.

Ważne jest, aby upewnić się, że matryca znajduje się w poziomie podczas procesu utwardzania. Po utwardzeniu PDMS na matrycy, zostaje on przeniesiony do komory z laminarnym przepływem powietrza za pomocą skalpela. Wzdłuż obwodu urządzeń wykonuje się cięcie okrężne.

Ważne jest, aby podczas wkładania ostrza w PDMS w celu nawiązania kontaktu z waflą krzemową nie wywierać zbyt dużego nacisku na waflę, w przeciwnym razie matryca pęknie, a urządzenia zostaną przecięte w całości w okrąg. Na każdej trzymacierowej wafli krzemowej znajdują się cztery urządzenia. Następnie ostrożnie oddziela się PDMS od matrycy.

Można to rozpocząć od delikatnego obracania skalpela podczas wprowadzania go w miejsce poprzedniego nacięcia. Urządzenia z PDMS na formie są bardzo cienkie. Rezerwuary skierowane powierzchnią do góry wykonuje się w urządzeniu, używając ośmiomilimetrowego dziurkacza do biopsji tkanek.

Pozostałości materiału w wycinaku są wypychane za pomocą pręta. Następnie urządzenia są dzielone na ćwiartki, a nadmiar PDMS jest przycinany tak, aby urządzenie idealnie pasowało do szkiełka nakrywkowego Corning. Używa się strumienia azotu, aby wydmuchać wszelkie pozostałości ze szkiełka nr 1 o wymiarach 24 mm na 40 mm.

Uporczywe zanieczyszczenia można również usunąć za pomocą taśmy winylowej 3M Scotch Brand 4 7 1. Oczyszczone urządzenia są teraz gotowe do wiązania plazmowego. W celu krótkotrwałego przytwierdzenia urządzeń neuronowych do szkiełek podstawowych wykorzystuje się cleaner plazmowy Herrick.

Urządzenia oraz szkiełka nakrywki umieszcza się na tacy, którą następnie wstawia się do oczyszczacza plazmowego, a za pomocą pompy próżniowej wypompowuje powietrze z komory. Należy zwrócić uwagę, aby urządzenia PDMS umieścić stroną górną do góry, tak aby powierzchnia z naniesionym wzorem była wystawiona na działanie gazu plazmowego.

Po osiągnięciu ciśnienia próżni na poziomie 300 millitorr, włączone zostaje zasilanie cewki elektrycznej i ustawione na wysoką moc. Drzwi zostają lekko uchylone, aby doprowadzić niewielką ilość powietrza do komory, co pomoże w wygenerowaniu plazmy. Urządzenia oraz szkiełka nakrywkowe są poddawane traktowaniu plazmą przez dwie minuty.

Zwróć uwagę na fioletowy kolor w komorze. Jest to właściwa plazma. Cewka elektryczna generuje plazmę, która jest częściowo zjonizowanym gazem składającym się z elektronów, jonów oraz neutralnych atomów lub cząsteczek.

Plazma tworzy reaktywne formy chemiczne na powierzchni szkła oraz urządzenia, co po ich połączeniu prowadzi do powstania trwałego wiązania. Plazma sprawia również, że powierzchnia staje się hydrofilowa, co ułatwia dodawanie cieczy. Oczyszczacz plazmowy sterylizuje ponadto urządzenia.

Po dwuminutowej obróbce plazmowej wyłącza się zasilanie w próżni i doprowadza powietrze do komory. Obrobione plazmowo powierzchnie szkła i urządzenia mikroprzepływowego są montowane w kontakcie ze sobą w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie urządzenia umieszcza się w sterylnych szalkach o średnicy 60 mm.

Powierzchnie szkła i urządzenia poddane działaniu plazmy tworzą trwałe, nieodwracalne wiązanie. W ciągu 10 minut od wiązania plazmowego urządzenie zostaje przyłączone do szkła, a następnie do urządzenia dodaje się poliolizynę. Po 10 minutach hydrofilowość urządzenia ulegnie zmniejszeniu.

Utrudnia to wprowadzenie PLL do urządzenia. Po dodaniu PLL należy sprawdzić, czy w urządzeniu nie pojawiły się pęcherzyki powietrza. Prostym sposobem na usunięcie obecnych pęcherzyków powietrza jest użycie pipety P 200 wypełnionej 100 µL cieczy.

W tym przypadku należy umieścić końcówkę pipety bezpośrednio przy otworze głównego kanału, a następnie energicznie wcisnąć tłok pipety P 200. Może to wymagać kilkukrotnego powtórzenia, jednak z czasem siła nacisku pipety wypchnie pęcherzyki powietrza. Urządzenia zawierające PLL inkubuje się przez noc w standardowym inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.

Po 24 godzinach inkubacji z PLL urządzenia płucze się dwukrotnie i szybko wodą dejonizowaną z autoklawu. Podczas tego procesu ciecz nie jest całkowicie usuwana z kanałów głównych, a jedynie z rezerwuarów. Usunięcie cieczy z kanałów głównych spowoduje powstanie pęcherzyków powietrza.

Po dwóch szybkich płukaniach urządzenia ponownie wypełnia się autoklawowaną wodą zdejonizowaną i umieszcza z powrotem w inkubatorze na minimum trzy godziny lub na całą noc. Następnego dnia, po inkubowaniu urządzeń w wodzie przez noc lub minimum trzy godziny, przenosi się je ponownie do komory biosafety i płucze dwukrotnie wodą zdejonizowaną. Następnie do urządzeń dodaje się pożywkę bazową dla neuronów (neural basal media) zawierającą niezbędne suplementy: B 27 oraz glutaminian do hodowli pierwotnych neuronów szczura.

Następnie urządzenia są umieszczane z powrotem w inkubatorze do późniejszego użycia. Urządzenia są teraz gotowe do wysiewu neuronów. W tym filmie zaprezentowaliśmy technikę miękkiej litografii, której używamy do produkcji naszych urządzeń neuronowych.

Urządzenia te mogą być wykorzystywane do hodowli neuronów oraz innych interesujących typów komórek. Główną zaletą tych urządzeń jest możliwość oddzielenia i przedzielenia hodowli ciał komórek neuronów po jednej stronie urządzenia od czystej frakcji aksonalnej po drugiej stronie. W następnym filmie pokażemy, w jaki sposób przygotowujemy neurony korowe z zarodków szczura w 18. dniu rozwoju (E 18) oraz jak wprowadzamy komórki do urządzenia.

To wszystko z laboratorium Johna. Dziękujemy za oglądanie.