Przygotowanie neuronów korowych szczura z 18. dnia embrionalnego (E18) do kompartymentacji w urządzeniu mikroprzepływowym

Witajcie w laboratorium dr. Newly’ego Johna. W poprzednim filmie zademonstrowaliśmy proces wytwarzania urządzenia neuronowego – platformy, która umożliwia badaczowi oddzielenie ciał neuronów od czystej frakcji aksonalnej. Do produkcji tych urządzeń wykorzystuje się technikę miękkiej litografii, która polega na odlewaniu i utwardzaniu PDMS na waflu krzemowym zawierającym projekt urządzenia, wykonany wcześniej metodą fotolitografii.

W tym filmie zaprezentujemy przygotowanie korowych neuronów szczurzych E18 z linii spro dolly oraz sposób ładowania neuronów do urządzenia neuronowego. Przedstawiam Państwu Kianę Lee, która przeprowadzi dzisiejsze demonstracje.

Przed rozpoczęciem procedury ważne jest, aby wszystkie niezbędne pożywki i odczynniki zostały ogrzane do 37 °C w kąpieli wodnej. Można zobaczyć pożywkę Neurobasal, 0,25% trypsynę oraz DMEM zawierający 10% FBS. Należy upewnić się, że wszystkie elementy umieszczane w komorze laminarnej w celu pasażowania komórek są wysterylizowane i przetarte 70% etanolem.

W pierwszej kolejności komorę do hodowli tkanek przeciera się 70% ethanol. Następnie plastikowe statywy służące do trzymania probówek spryskuje się ethanolem. W kolejnym kroku gumową piłeczkę używaną w procesie rozprzestrzeniania próbki (tri striation) czyści się ethanolem.

Ważne jest, aby wykonać ten krok odpowiednio wcześnie, aby zapewnić wystarczający czas na wyschnięcie. Następnie niezbędne odczynniki przeciera się etanolem i przenosi do komory z wyciągiem. Dwa fragmenty kory płodowej szczura w stadium E 18, pochodzące z jednego wcześniej wypreparowanego mózgu, umieszcza się w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 1 ml lodowatego buforu do dyssekcji, wolnego od wapnia i magnezu. Do kory w buforze dodaje się 1 ml 0,25% trypsyny z EDTA, co zwiększa objętość końcową do 2 ml, a końcowe stężenie trypsyny do 0,125%. Probówkę 15 ml z korą po dodaniu trypsyny umieszcza się następnie w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na osiem minut, podczas których kora płodowa inkubuje się w trypsynie w temperaturze 37 °C.

Trzy pipety Paste poddaje się wypalaniu. Końcówkę szklanej pipety umieszcza się w bezpośrednim kontakcie z płomieniem, w pobliżu jego niebieskiej części, i powoli obraca, aż sam otwór przybierze pomarańczowy kolor. W momencie, gdy stał się pomarańczowy.

Ważne jest, aby stale obracać szklaną pipetę, aby zapobiec jej zapadnięciu się. Należy zauważyć, że otwory szklanych pipet są sukcesywnie mniejsze. Ważne jest również, aby nie czynić otworów zbyt małymi, ponieważ może to spowodować lizę komórek po inkubacji kory przez osiem minut w temperaturze 37°C z trypsyną. Do kory dodaje się 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS, aby pomóc zatrzymać reakcję trypsyny.

Probówkę o pojemności 15 ml zawierającą korę i DMEM 10%FBS wiruje się przy 2 500 RPM przez dwie minuty. W komorze z laminarnym przepływem powietrza używa się ssania próżniowego przymocowanego do pipety szklanej, aby usunąć nadsącz z kory. Należy przy tym uważać, aby nie naruszyć ani nie przemieścić osadu.

Do osadu z kory dodaje się 1 ml pożywki bazowej dla neuronów zawierającej B 27 i glutaminian, a następnie delikatnie miesza za pomocą pipety. Bardzo ważne jest, aby podczas pipetowania nie tworzyć pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one uszkodzić komórki w wyniku utleniania. Następnie, przy użyciu wypalanej ogniem pipety tylnej o najszerszym otworze, dokonuje się tritykacji kory, mocując sterylną gumową gruszkę do końca pipety i pipetując ciecz w górę i w dół około pięciu razy.

Należy uważać, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza. Dobrze. Proces kontynuowano z pozostałymi dwiema pipetami szklanymi, z których każda miała mniejszą średnicę otworu. Jak wspomniano wcześniej, podczas procesu rozwarstwiania (striacji) ważne jest upewnienie się, że nie wprowadzono żadnych pęcherzyków powietrza.

Należy również zauważyć, że nie widać już żadnych widocznych fragmentów. Ważne jest kontynuowanie procesu trituracji aż do momentu, gdy w materiale nie będą już widoczne żadne fragmenty kory. Po trituracji komórki ponownie wiruje się przy 2 500 RPM przez dwie minuty.

Jest to przybliżony rozmiar osadu, jakiego można się spodziewać po dwóch fragmentach kory. Po wirowaniu nadłożu ponownie usuwa się z osadu komórkowego. Po usunięciu nadłożu do kory dodaje się 1 ml pożywki neurobasal zawierającej B 27 i glutaminian, aby ponownie zawiesić tkankę kory.

Osad komórkowy ponownie pipetuje się ostrożnie w górę i w dół, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza oraz zapewnić równomierne rozproszenie i rozbicie osadu. Do zawiesiny komórkowej dodaje się kolejny 1 ml pożywki neurobasal, tak aby objętość końcowa wyniosła 2 ml. Następnie resuspenderowany roztwór komórek filtruje się przez sitko komórkowe 40 µm marki BD Biosciences, aby zliczyć komórki i ocenić ich żywotność.

Do sterylnej probówki do wirówki mikrocentryfugi przelewa się 60 µL świeżej pożywki bazowej dla neuronów. Następnie do 60 µL pożywki bazowej dodaje się 20 µL komórek, a na koniec do komórek w pożywce bazowej dodaje się 20 µL błękitu trypanowego. Błękit trypanowy zabarwi komórki martwe po przeprowadzeniu procesu barwienia.

Nanosimy pipetą 20 µL na komorę counting chamber (hemo-cytometr) i obserwujemy je pod mikroskopem. Żywe komórki są przezroczyste, natomiast komórki z uszkodzonymi błonami wybarwiają się na niebiesko dzięki zastosowaniu błękitu trypanu. Typowo otrzymujemy około 2,5 miliona komórek oraz 8 milionów komórek z kory.

Zazwyczaj pobieramy dwa fragmenty kory z jednego mózgu, a komórki resuspendujemy w objętości końcowej 2 ml. W związku z tym końcowe stężenie komórek wynosi zazwyczaj od 2,5 miliona komórek/ml do 8 milionów komórek/ml. Standardowo nanosimy około 20 µl zawiesiny komórek na urządzenie.

Zapewnia to zakres od 50 000 do 160 000 komórek na urządzenie. Gęstość komórek można zmieniać w zależności od zastosowania. Jednakże wysiewanie pierwotnych neuronów przy zbyt niskiej gęstości zazwyczaj prowadzi do śmierci komórek. Wcześniej przygotowane urządzenia zawierające podstawowe medium dla neuronów są przenoszone do komory z laminarnym przepływem powietrza w celu zachowania sterylności.

Nadmiar pożywki z dołków usuwa się za pomocą ssaka próżniowego. Należy jednak uważać, aby nie usunąć całej pożywki. W kanale głównym musi pozostać pewna ilość pożywki; należy aspirować pożywkę wyłącznie z rezerwuarów.

Do górnego lewego zbiornika urządzenia nanosi się jedynie 20 µL komórek. Komórki wpływają do urządzenia i przywierają do powierzchni potraktowanej PLL. Tutaj widać komórki przepływające przez kanał główny, a następnie można zauważyć niektóre z nich, które faktycznie przywarły do szkła.

Po załadowaniu urządzenia zawierające komórki są umieszczane z powrotem w inkubatorze na około 10 minut, aby umożliwić komórkom adhezję. Po 10 minutach w inkubatorze urządzenia są ponownie przenoszone do komory z laminarnym przepływem powietrza, zbiorniczki są napełniane pożywką, a następnie urządzenia są umieszczane z powrotem w inkubatorze. Należy zwrócić uwagę na ważne kwestie: w zależności od typu inkubatora i wymaganego poziomu wilgotności, pożywkę w urządzeniach może być konieczne wymieniać co dwa lub trzy dni.

Zasadą dobrej praktyki jest umieszczenie świeżego medium w górnych studzienkach i dopuszczenie do przepływu części świeżego medium przez urządzenie do głównych kanałów przed całkowitym napełnieniem wszystkich zbiorników. Neurony są tutaj wizualizowane za pomocą barwnika wapniowego, który jest barwnikiem przenikającym przez błony komórkowe i barwi żywe komórki. Tutaj można zobaczyć przedział S0 lub stronę komórkową urządzenia, która zawiera ciała komórek, aksony i dendryty.

Podczas przesuwania widoku nad urządzeniem można zauważyć mikrowżobienia, przez które rosną aksony, aby dotrzeć na drugą stronę urządzenia – stronę aksonalną, która zawiera czystą frakcję aksonów. W celach demonstracyjnych te komórki znakowane fluorescencyjnie zostaną wykorzystane do zilustrowania procedury aksonotomii.

Jedną z właściwości urządzenia neuronowego jest to, że pozwala ono badaczowi na przeprowadzenie aksonotomii, czyli odcięcia aksonów od czystej frakcji aksonalnej urządzenia, w celu prowadzenia badań takich jak analiza regeneracji aksonów. Keano zademonstruje teraz sposób wykonania aksonotomii w urządzeniu neuronowym; aksonotomia jest przeprowadzana za pomocą próżni.

Sterylną pipetę szklaną umieszcza się w dolnym otworze studni po stronie aksonalnej, a następnie odsysa pożywkę za pomocą próżni. Całą pożywkę całkowicie usuwa się ze strony aksonalnej urządzenia, w tym z kanału głównego. Aby powtórzyć ten proces po usunięciu pożywki, do kanału głównego wtłacza się 150 µL pożywki, przykładając końcówkę pipety do otworu kanału głównego i zdecydowanie naciskając pipetę.

Następnie do otworu głównego kanału oraz górnego otworu po stronie aksonalnej urządzenia przyłożone zostaje podciśnienie. Próżnię wykorzystuje się ponownie do usunięcia całego medium ze strony aksonalnej, w tym z głównego kanału. Ponownie 150 µL medium jest wtłaczane do głównego kanału poprzez umieszczenie końcówki pipety w otworze głównego kanału i mocne naciśnięcie pipety.

Na tym etapie badacz może obejrzeć urządzenie pod mikroskopem, aby sprawdzić efektywność przecięcia aksonów. Jeśli aksony nie zostały przecięte w wystarczającym stopniu, proces można powtórzyć w razie potrzeby. W tym filmie pokazaliśmy, jak przygotować neurony korowe płodu szczura w 18. dniu rozwoju (E 18) i załadować je do urządzenia neuronowego.

Główną zaletą tych urządzeń jest możliwość oddzielenia i przedzielenia hodowli ciał komórek neuronów po jednej stronie urządzenia od czystej frakcji aksonalnej po drugiej stronie urządzenia. Mamy nadzieję, że ten film był dla Państwa informacyjny i pomocny. To wszystko z Laboratorium Johna.

Dziękujemy za oglądanie.