Pasażowanie ludzkich neuralnych komórek macierzystych
22 sierpnia 2007
Zdolność do manipulowania ludzkimi komórkami macierzystymi/prekursorowymi neuronów (hNSPCs) in vitro pozwala badać ich przydatność jako przeszczepów komórkowych do celów terapeutycznych oraz zgłębiać proces rozwoju ludzkiego układu nerwowego. Niniejszy protokół przedstawia metodę hodowli i pasażowania hNSPCs w celu zwiększenia powtarzalności badań nad ludzkimi komórkami macierzystymi.
Cześć, jestem Steve. Pracuję w laboratorium dr. Flanagana w Katedrze Patologii na UC Irvine. Dzisiaj pokażę wam, jak pasażować ludzkie komórki prekursorowe neuronów.
Technika ta polega na powleczeniu nowej kolby roztworem ludzkiej fibronektyny, ododerwaniu komórek za pomocą buforu do dysocjacji komórek, a następnie zneutralizowaniu buforu do dysocjacji komórek 10% roztworem surowicy, odwirowaniu zawiesiny komórkowej, ponownym zawieszeniu komórek w świeżym medium i przeniesieniu zawiesiny komórkowej do nowej kolby. W naszym laboratorium hodujemy ludzkie komórki prekursorowe neuronów, wymieniając połowę medium co drugi dzień i pasażując je około raz w tygodniu w rozcieńczeniu od 1:2. Podczas pasażowania komórek mogę je policzyć, jeśli chcę wykorzystać je do eksperymentu z immunochemii lub jeśli planuję przeprowadzić transfekcję efektorem jądrowym.
Podczas pakowania komórek ważne jest zastosowanie buforu do dysocjacji komórek, ponieważ po pierwsze nie jest on enzymatyczny (w przeciwieństwie do trypsyny) i jest znacznie łagodniejszy dla komórek. Cześć, znajdujemy się teraz w pomieszczeniu do hodowli tkanek i zanim pokażę wam, jak wygląda konfluencyjna kolba z ludzkimi komórkami prekursorowymi, najpierw przygotuję stanowisko do hodowli tkanek. Najpierw wyłączę lampę UV, a następnie włączę oświetlenie i przepływ powietrza.
Następnie zdezynfekuję komorę dygestorium za pomocą 70% ethanolu, spryskując ręcznik papierowy i przecierając nim powierzchnię. Ważne jest, aby spryskać 70% ethanolem ręcznik papierowy, a nie wnętrze komory bezpośrednio, ponieważ rozpylanie 70% ethanolu wewnątrz dygestorium może uszkodzić filtr HEPA, który jest bardzo kosztowny. Następnie spryskam wszystkie odczynniki i przyrządy.
Na koniec spryskam węże próżniowe i będziemy gotowi. Przyjrzyjmy się tym komórkom. Wyglądają one na około 80% konfluencji.
Są to ludzkie komórki prekursorowe neuronów wyizolowane z ludzkich płodów, które hodujemy w kolbach T 25. Przesiewamy je mniej więcej co tydzień, w stosunku od jeden do dwóch. Jestem teraz gotowy do pasażowania komórek.
Najpierw wezmę nową kolbę T 25, którą powlekałem przez cztery godziny ludzką fibronektyną od BD biosciences. Usunąłem roztwór fibronektyny. Przepłuczę tę kolbę za pomocą BBS przed przeniesieniem do niej komórek.
A teraz wyjmę komórki z inkubatora ustawionego na 37°C. Oto są. Teraz usunę roztwór płuczący PBS z nowej kolby, która została pokryta ludzką fibronektyną.
Następnie dodam 2 mL starej pożywki kondycjonowanej do nowej kolby. Teraz muszę opłukać komórki roztworem PBS przed ich odseparowaniem z powierzchni. Najpierw usunę pozostałą pożywkę i niezwłocznie dodam około 2 mL PBS, aby zapobiec wyschnięciu komórek.
Odczekam około dwóch minut przed usunięciem PBS i dodaniem buforu do dysocjacji komórek, aby oddzielić komórki od powierzchni kolby. Teraz usunę PBS i ponownie postaram się bezzwłocznie dodać bufor do dysocjacji komórek, aby zapobiec ich wyschnięciu. Dodam 1,5 ml buforu do dysocjacji komórek.
W przeciwieństwie do PBS, dodam go bezpośrednio na komórki, starając się pokryć jak największą powierzchnię. Przesuwam więc kolbę z boku na bok, powoli dodając bufor na komórki. Teraz odczekam około pięciu minut, aż komórki zaczną odrywać się od powierzchni.
Kolbę pozostawię w temperaturze pokojowej w dygestorium. Jak widać, komórki najpierw zaczynają się zaokrąglać, a następnie odrywać od powierzchni; można już zauważyć niektóre pływające komórki. Delikatne opukanie kolby z boku pomoże im się odrodzić.
Minęło pięć minut i, jak widać, roztwór stał się bardzo gęsty od komórek, które oddzieliły się od powierzchni. Teraz zneutralizuję działanie buforu do dysocjacji komórek, dodając 4,5 ml pożywki z surowicą. Użyję pożywki DMEM/F12 z dodatkiem 10% inaktywowanego ciepłem płodowej surowicy bydlęcej i dodam ją bezpośrednio na powierzchnię kolby, aby upewnić się, że żadne komórki nie pozostały przytwierdzone.
Następnie będę delikatnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby odłączyć wszystkie pozostałe komórki. Potem przeniosę zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 15 ml i odwiruję ją z prędkością 1000 RPM przez jedną minutę.
Wirowanie komórek dobiegło końca i otrzymaliśmy wyraźny osad komórkowy. Bardzo ostrożnie usunę pożywkę z surowicą, aby nie naruszyć osadu. Następnie zawieszę osad w 4 ml pożywki.
Spróbuję teraz resuspender osad w taki sposób, aby nie pozostały żadne skupiska komórek, tak aby roztwór stał się jednorodny i nie zawierał grudek. Ponieważ wykonuję pasaż w stosunku 1:2, pobiorę 2 ml z 4 ml i przeniosę je do nowej kolby, która zawiera już 2 ml pożywki warunkowej. Na koniec opiszę kolbę, podając typ komórek, numer pasażu oraz datę.
Oto widok komórek, które pasażowaliśmy pół godziny temu. Jak widać, większość z nich przywarła do powierzchni i zaczęła wytwarzać wypustki. To wszystko.
A teraz jestem gotowy do odliczania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę hodowli i pasażowania ludzkich komórek macierzystych/prekursorowych układu nerwowego (hNSPCs) in vitro. Technika ta ma na celu zwiększenie powtarzalności badań nad ludzkimi komórkami macierzystymi oraz ułatwienie badania rozwoju układu nerwowego i potencjalnych zastosowań terapeutycznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórek macierzystych
- Techniki hodowli komórkowych
Wstęp
- Ludzkie neuralne komórki macierzyste/prekursorowe (hNSPCs) są kluczowe dla badania rozwoju układu nerwowego.
- Manipulacje in vitro hNSPCs mogą prowadzić do postępów w terapii.
- Powtarzalność w badaniach nad komórkami macierzystymi jest niezbędna dla postępu naukowego.
- Techniki hodowli komórkowych stanowią fundament badań w dziedzinie neuronauki.
Cel badania
- Aby zapewnić niezawodną metodę hodowli hNSPCs.
- Aby ułatwić wykorzystanie hNSPCs w zastosowaniach eksperymentalnych.
- Aby pogłębić zrozumienie rozwoju układu nerwowego człowieka.
Zastosowane metody
- Powlekanie kolb ludzką fibronektyną.
- Użycie buforu do dysocjacji komórek w celu odzyskania komórek.
- Neutralizacja buforu do dysocjacji roztworem surowicy.
- Wirowanie i resuspensja komórek w świeżej pożywce.
Główne wyniki
- Skuteczne pasażowanie hNSPCs przy użyciu opisanego schematu.
- Poprawa powtarzalności praktyk hodowli komórkowej.
- Potencjał zastosowania w eksperymentach z zakresu immunochemii i transfekcji.
- Ustalenie rutyny wymiany pożywek i częstotliwości pasażowania.
Wnioski
- Protokół zapewnia systematyczne podejście do hodowli hNSPC.
- Poprawa powtarzalności może prowadzić do lepszych wyników doświadczalnych.
- Dalsze badania mogą zgłębić potencjał terapeutyczny hNSPC.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Znormalizowane pasażowanie ludzkich komórek macierzystych/prekursorowych neuronów (hNSPCs) umożliwia tworzenie powtarzalnych modeli in vitro do walidacji celów oraz mechanistycznej redukcji ryzyka w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Niezawodna ekspansja hNSPCs zapewnia spójne materiały wejściowe do testów w programach przesiewania fenotypowego i identyfikacji związków wiodących. Niniejszy protokół odnosi się do zmienności w hodowli komórek macierzystych, która może zaburzać badania nad biomarkerami translacyjnymi oraz wierność modeli przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie modulacji szlaków neuronalnych przy użyciu genetycznie stabilnych hNSPCs wykazujących ekspresję nestiny i SOX2.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność indukowaną hodowlą, która utrudnia odczyt angażowania celu w badaniach przesiewowych na wczesnym etapie.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia adherentne hNSPC o morfologii bipolarnej, odpowiednie do obrazowania wysokiej treści (high-content imaging) w celu analizy wypustek neurytowych lub ekspresji markerów synaptycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzowany pasaż 1:2 co 7 dni pozwala na skalowanie gęstości zasiewu dla testów na płytkach wielodołkowych.
- Wartość strategiczna: Kolby powlekane fibronektyną poprawiają efektywność adhezji, co zmniejsza niespójność między poszczególnymi dołkami podczas przesiewania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Utrzymuje ekspresję markerów niedróżnicowanych, zachowując wielopotencjalność niezbędną do różnicowania w neuronalne podtypy istotne dla badanej choroby.
- Wartość operacyjna: Przenoszenie pożywki warunkującej podczas pasażowania wspomaga badania nad czynnikami parakrynnymi istotnymi dla szlaków neurozapalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda pasażowania wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu, poprzez optymalizację analizy, aż po tworzenie modeli przedklinicznych, gdzie spójność hNSPC wpływa na wiarygodność danych na poszczególnych etapach.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez kontrolowaną ekspansję hNSPCs na potrzeby przesiewu CRISPR lub badań nad nadekspresją.
- Przesiewanie: Umożliwia uzyskanie powtarzalnej gęstości wysiewu w celu kwantyfikacji wpływu związków na żywotność komórek lub markery różnicowania.
- Analityka: Pozwala na uzyskanie homogenicznych zawiesin odpowiednich do cytometrii przepływowej lub immunocytochemii w celu uzyskania ilościowych odczytów.
- Badania translacyjne: Stanowi łącznik z pracami przedklinicznymi, dostarczając skalowalne źródło neuronów lub gleju do badań nad skutecznością transplantacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Określona częstotliwość powlekania i pasażowania umożliwia transfer technologii pomiędzy ośrodkami w ramach wieloprojektowych programów komórek macierzystych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w testach opartych na komórkach macierzystych poprzez zminimalizowanie dryfu indukowanego pasażowaniem.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja etapów dysocjacji i neutralizacji poprawia powtarzalność wyników z dnia na dzień.
- Wartość strategiczna: Umożliwia efektywne kosztowo skalowanie poprzez ograniczenie liczby nieudanych partii wynikających z niespójności subkultur.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje skorygowane o ryzyko w portfolio badań nad chorobami neurodegeneracyjnymi poprzez poprawę wierności danych w kaskadach walidacji celów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest przeszkolenie z technik aseptycznych w celu bezpiecznego obchodzenia się z buforami do dysocjacji oraz suplementami seryjnymi.
- Konieczny jest dostęp do naczyń hodowlanych powleczonych ludzką fibronektyną oraz sterylnych probówek stożkowych do wirowania.
- Niezbędna jest standaryzacja czasu pasażowania w odniesieniu do stopnia konfluencji (~80%), aby uniknąć różnicowania indukowanego nadmiernym wzrostem.
- Adaptacja do hodowli w zawiesinie lub kultur sferoidów wymagałaby modyfikacji macierzy wykraczających poza powlekanie fibronektyną dla komórek adherentnych.
- Metoda ograniczona do operacji w skali badawczej; pasażowanie zgodne z GMP wymagałoby bioreaktorów w systemie zamkniętym i kwalifikowanych odczynników.
