iCLIP – Mapowanie oddziaływań białko-RNA w całym transkryptomie z rozdzielczością pojedynczych nukleotydów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest uzyskanie mapy miejsc wiązania białka wiążącego RNA w całym transkryptomie z rozdzielczością pojedynczego nukleotydu. Osiąga się to poprzez naświetlanie żywych komórek promieniami UV w celu kowalencyjnego sieciowania białek i RNA in vivo jako drugiego etapu. Białko wiążące RNA jest oczyszczane immunologicznie w warunkach rygorystycznych, aby odzyskać sieciowane fragmenty RNA.

Kolejna odwrotna transkrypcja generuje cDNA, które często ulegają skróceniu w miejscu przyłączonego peptydu, co pozwala zachować informacje o pozycji wiązania krzyżowego w obrębie RNA. Uzyskane wyniki wskazują wszystkie miejsca wiązania w transkryptomie na podstawie wysokoprzepustowego sekwencjonowania biblioteki cDNA. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii RNA, takie jak wpływ oddziaływań różnych białek wiążących RNA na regulację procesingu RNA. Główną zaletą tej techniki jest zwiększenie zarówno wydajności, jak i rozdzielczości map interakcji białko-RNA w całym transkryptomie. Aby rozpocząć procedurę sieciowania UV komórek hodowli tkankowej.

Usunąć pożywkę z płytki 10 centymetrów z komórkami healer. Dodać sześć mililitrów lodowatego PBS i umieścić płytki na lodzie. Jedna płytka jest wystarczająca dla trzech eksperymentów.

Zdejmij pokrywkę i poddaj komórki napromieniowaniu. Po naświetleniu długością fali 254 nanometrów z dawką 150 milidżuli na centymetr kwadratowy, zbierz komórki, zdrapując je z płytek za pomocą cell lifter, a następnie przenieś 2 mL zawiesiny komórkowej do każdej z trzech mikroproletek w celu odwirowania osadu. Wirowanie przeprowadź z maksymalną prędkością przez 10 sekund w temperaturze 4 °C.

Następnie zdejmij zatrzask odwirówki, zamroź osady komórkowe na suchym lodzie i przechowuj w temperaturze minus 80 °C do momentu użycia. Do nowej mikroprobówki dodaj 100 µL protein G DynaBeads na eksperyment. W przypadku pracy z przeciwciałami mysimi lub kozimi należy użyć protein G DynaBeads.

Przemyj kuleczki dwukrotnie buforem do lizy, którego skład znajduje się w załączonym protokole pisemnym. Resuspenduj kuleczki w 100 µL buforu do lizy z dodatkiem od 2 do 10 µg przeciwciała. Inkubuj probówkę w rotatorze w temperaturze pokojowej przez 30 do 60 minut.

Następnie przemyć kuleczki trzy razy 900 µL buforu lizującego i pozostawić je w ostatniej porcji buforu do czasu rozpoczęcia kolejnego etapu. Do immunoprecypitacji przygotować osad komórkowy Thor na lodzie. Resuspendować go w 1 mL buforu lizującego i przenieść do probówki mikropoziomowej o pojemności 1,5 mL.

Przygotować rozcieńczenie RNAs one w stosunku 1:500. Następnie dodać 10 µL wraz z 2 µL turbo DNAs do lizatu komórkowego (cell.Lysate). Próbki inkubować przez dokładnie 3 minuty w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 100 obr./min, a następnie natychmiast przenieść na lód.

Następnie odwirować próbki w temperaturze 4°C przy 22 000 ×g przez 20 minut, aby oczyścić lizat. Ostrożnie zebrać naddatek, pozostawiając około 50 µL lizatu z osadem, aby przeprowadzić immunoprecypitację na kulkach. Usunąć bufor płuczący, a następnie dodać przygotowane lizaty komórkowe. Inkubować próbki w rotacji przez dwie godziny w temperaturze 4°C.

Odciśnij supernatant i przemyj kulki dwukrotnie 900 µL buforu wysokosolowego, którego skład opisano w towarzyszącym protokole pisemnym. Na koniec przemyj kulki dwukrotnie 900 µL buforu do przemywania. Następnie przystąp do defosforylacji i dołączenia łącznika do końców 3' RNA.

Aby oznakować końce 5' RNA, należy pracować za osłoną z pleksiglasu. Odwirować osad z ostatniego etapu przemywania reakcji ligacji łącznika i resuspendować kuleczki w 8 µL gorącej mieszaniny PNK. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.

Usunąć gorącą mieszaninę PNK i użyć jej ponownie. Zawiesić kuleczki w 20 µL jednogodzinnego buforu do ładowania żelu. Następnie inkubować próbkę w termomikserze w temperaturze 70 °C przez 10 minut.

Próbkę należy niezwłocznie umieścić na magnesie, aby wytrącić puste kulki. Próbki nanosi się na żel SDS-PAGE o stężeniu od 4 do 12% zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie nanieś pięć µL wstępnie zabarwionego markera wielkości białek. Prowadź elektroforezę żelu przez 50 minut przy napięciu 180 V. Przenieś kompleksy białko-RNA z żelu na membranę nitrocelulozową, korzystając z aparatu do transferu mokrego NOVA zgodnie z instrukcjami producenta.

Po transferze przemyj membranę buforem PBS. Następnie owiń ją folią Saran i poddaj ekspozycji na film w temperaturze -80 °C. Wykonaj ekspozycje trwające 30 minut, jedną godzinę oraz przez noc.

Następnie wyizoluj obszar błony odpowiadający kompleksom białkowo-RNA z frakcji RNA o niskiej zawartości. Przeprowadź eksperyment, wykorzystując autoradiograf jako maskę. Odzyskaj RNA z błony poprzez trawienie proteinazą K oraz ekstrakcję fenolo-chloroformową.

Przeprowadź odwrotną transkrypcję RNA przy użyciu jednego z starterów AYP, aby oczyścić cDNA w żelu. Wymieszaj 6 µL próbki cDNA z 6 µL dwukrotnego buforu ładowania TBE urea. Wykonaj to bezpośrednio przed nałożeniem próbek na żel.

Podgrzewaj próbki do 80 °C przez trzy minuty. Następnie nanieś próbki na gotowy żel z mocznikiem 6% TBE wraz z markerem o niskiej masie cząsteczkowej. Pozostaw żel do elektroforezy na 40 minut przy napięciu 180 V, zgodnie z instrukcją producenta, wykorzystując górny barwnik oraz oznaczenia na plastikowej podkładce żelu w celu precyzyjnego wycięcia prążków.

Wytnij trzy prążki o długości od 120 do 200 nukleotydów, od 85 do 120 nukleotydów oraz od 70 do 85 nukleotydów. Należy pamiętać, że starter arc lip oraz sekwencja L three łącznie stanowią 52 nukleotydy sekwencji clip. Dodaj 400 µL buforu te i rozdrobnij wycinek żelu na małe kawałki.

Używając tłoka strzykawki o pojemności 1 mL, inkubuj fragmenty żelu przy wstrząsaniu z prędkością 1100 obr./min przez dwie godziny w temperaturze 37 °C. Umieść dwa szklane przefiltrowania wstępne o średnicy 1 cm w kolumnie wirowej CoStar. Przenieś ciekką część próbki do kolumny i wiruj przez jedną minutę przy 13 000 obr./min do probówki o pojemności 1,5 mL.

Dodaj 0,5 µL glyco blue oraz 40 µL octanu sodu o pH 5,5. Następnie wymieszaj próbkę. Dodaj 1 mL 100% etanolu.

Ponownie wymieszać i wytrącić próbkę przez noc w temperaturze -20 °C. Następnie zcyklizować cząsteczki CD NA, aby przyłączyć region adaptera do końca pięć pierwszego. Następnie zlinearyzować i namnożyć metodą PCR zgodnie z towarzyszącym protokołem pisemnym przed sekwencjonowaniem biblioteki eye clip; powodzenie eksperymentu można monitorować na dwóch etapach.

Autoradiogram kompleksu białko-RNA po transferze na membranę oraz obraz żelu produktów PCR w autoradiogramie próbek z niską zawartością RNA; w przypadku próbek z wysoką zawartością RNA powyżej masy cząsteczkowej białka powinna być widoczna rozproszona radioaktywność. Radioaktywność ta jest skoncentrowana bliżej masy cząsteczkowej białka. W przypadku braku użycia przeciwciała w immunoprecypitacji nie powinien być wykryty żaden sygnał.

Dalsze istotne kontrole specyficzności immunoprecypitacji polegają na pominięciu naświetlania UV lub zastosowaniu komórek, które nie wykazują ekspresji białka docelowego. Obraz żelu z produktami PCR powinien wykazać zakres wielkości odpowiadający frakcji CD NA. Należy zauważyć, że startery PCR, P three Celexa i P five Celexa, wprowadzają dodatkowe 76 nukleotydów do wielkości CD NA. Jeśli podczas immunoprecypitacji nie zostanie użyte przeciwciało, nie powinno zostać wykryte odpowiadający mu produkt PCR.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że każdy z 64 kroków jest krytyczny i musi zostać przeprowadzony ze stuprocentową dokładnością. Dane ICL mogą zostać zintegrowane obliczeniowo z funkcjonalnymi analizami całego transkryptomu. Może to na przykład pozwolić na uzyskanie wglądu w regulację przetwarzania RNA zależną od pozycji.

W celu obliczeniowej analizy danych odsyłamy do naszych ostatnich publikacji przygotowanych we współpracy z Nicholas KA z European Bioinformatics Institute oraz bla zupan z University of Liana. Teraz nadszedł czas, abyś rozpoczął własne eksperymenty. Powodzenia.