Analiza funkcji małych GTPaz poprzez mikroiniekcję plazmidów do spolaryzowanych komórek nabłonkowych

Niniejsza procedura służy do badania wpływu małych białek GTPazy ACE na polaryzowany transport błonowy. W pierwszej kolejności należy współwstrzyknąć plazmidy DNA kodujące małe białko GTPaza ACE oraz białka reporterowe do jąder komórkowych spolaryzowanych komórek. Następnie należy przeprowadzić ekspresję DNA w temperaturach, które zatrzymają białka reporterowe w retikulum endoplazmatycznym lub w sieci trans-Golgi (TGN), podczas gdy małe białko GTPA będzie gromadzić się w cytozolu; następnie należy przeprowadzić fazę „chase” białka reporterowego do powierzchni komórki w obecności cykloheksymidu, aby zapobiec dalszej syntezie białek.

Na koniec należy oznakować białko reporterowe na powierzchni komórki w celu przeprowadzenia analizy immunofluorescencyjnej. Wyniki uzyskane w tym badaniu pozwalają na wizualizację zmian w lokalizacji powierzchniowej przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak transfekcja, jest fakt, że podczas krótkiego czasu nadekspresji uzyskiwanego dzięki mikroiniekcji efekty wtórne są minimalne, co pozwala na badanie pierwotnych efektów białek docelowych.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie polarności komórkowej, takie jak sposób, w jaki małe białka gtpa regulują spolaryzowany transport błonowy. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ poszczególne kroki niezbędne do przeprowadzenia udanej mikroiniekcji są trudne do wyjaśnienia bez pomocy wizualnej. Wyizoluj wolne od endotoksyn plazmidowe DNA za pomocą zestawu Sigma Aldrich endotoxin free maxi prep zgodnie z protokołem producenta. W tym doświadczeniu do hodowli wykorzystaj trzy przezroczyste filtry transwell o średnicy 12 mm i rozmiarze porów 0,4 µm.

Na każdy filtr nanosi się 4 × 10⁵ komórek MDCK. Po dwóch dniach należy zbadać hodowlę pod mikroskopem, aby zweryfikować, czy komórki tworzą zamkniętą monowarstwę. Do mikroiniekcji.

W dniu mikroiniekcji przygotować płytki o wymiarach 360 na 15 mm z pięcioma litrami pożywki wzrostowej MM oraz 15 mM HEIS i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 39°C. Dodatkowo przygotować trzy płytki 12-dołkowe z jednym mililitrem pożywki wzrostowej MEM oraz 50 mM HEIS i 0,1 mg/mL cykloheksymidu, a następnie umieścić je w inkubatorze w temperaturze 31°C. Włączyć mikroskop do mikroiniekcji, skonfigurowany jako mikroskop odwrócony z grzanym stolikiem, obiektywami 10x i 32x oraz systemem FemtoJet.

Ustaw podgrzewany stolik na 39 °C. Otwórz również dopływ azotu z butli do stołu pneumatycznego. Następnie rozcieńcz DNA filtrowaną wodą do końcowego stężenia 0,2 mg/mL.

Następnie wirować DNA w mikrowirówce przy 13 000 RPM przez 30 minut. Odobrać górną warstwę i przenieść do nowej probówki. Następnie przygotować komórki MDCK, wyjmując pierwszy filtr z naczynia hodowlanego za pomocą skalpela, wycinając filtr z uchwytu i umieszczając go w przygotowanej płytce 60 by 15 mm zawierającej pięć mililitrów podgrzanej do 39 °C pożywki wzrostowej MEM z dodatkiem 50 mM HEES.

Aby obciążyć filtr w płytce hodowlanej, należy umieścić skalpel w centrum filtra, a następnie przenieść płytkę hodowlaną na podgrzewany stolik mikroskopu. Nabierz dwa do trzech µL rozcieńczonego DNA do igły do mikroiniekcji. Odkręć osłonę ochronną igły i odłóż ją na bok.

Aby umieścić igłę w uchwycie, naciśnij klawisz menu w strzykawce i upewnij się, że zawór jest zamknięty. Wkręć igłę do uchwytu. Należy uważać, aby nie wkręcać igły zbyt mocno.

Aby uniknąć uszkodzenia, ponownie naciśnij klawisz menu. Dzięki temu zastosowane ciśnienie kompensacyjne zapobiegnie zasysaniu medium do igły podczas procedury mikroiniekcji. Na koniec dotknij dżojstika, aby wymazać zapamiętany punkt startowy i opuścić igłę na komórki.

Użyj obiektywu 10x i wprowadź igłę w wiązkę światła nad cieczą. Następnie ustaw ostrość na komórkach. Ponownie przesuń płaszczyznę ostrości w górę, obracając pokrętło ostrości o 180 stopni w górę, i zlokalizuj igłę.

Powoli przesuń igłę, aby uzyskać ostrość. Następnie ponownie ją rozostrz. Pracuj nad tym, aby ponownie uzyskać ostrość obrazu komórek.

Ponownie ustaw ostrość na igłę. Powtarzaj czynność, aż igła dotknie powierzchni podłoża, co objawi się pojawieniem obwódki (halo). Kontynuuj, aż osiągniesz punkt, w którym komórki będą ostre, ale igła pozostanie rozmyta, znajdując się poza płaszczyzną ogniskową.

Przełącz teraz na obiektyw 32x i dokonaj ustawień wstępnych. Ustaw limit osi Z, dotykając końcówką igły błony apikalnej i odejmując około 10 µm, ponieważ jądra komórkowe znajdują się w odległości około 10 µm pod błoną apikalną.

Teraz przesuń igłę o kilka mikronów poza płaszczyznę ogniskową tak szybko, jak to możliwe. Wyceluj igłę powyżej jądra komórkowego, a następnie naciśnij i zwolnij przycisk wtrysku w joysticku. Zacznij od 95 PSI, aby dobrać odpowiednie ciśnienie wtrysku.

Jeśli ciśnienie jest zbyt wysokie, komórki pękają. Jeśli ciśnienie jest zbyt niskie, widoczna pozostaje biała kropka, ale nic innego się nie dzieje. Przeprowadź pomyślną iniekcję obejmującą zmianę fazy bez zmiany rozmiaru komórki.

Wstrzyknij od 100 do 500 komórek do otworu w skalpelu, który spoczywa na komórkach. Następnie umieść komórki wraz z naczyniem hodowlanym i skalpelem w inkubatorze w temperaturze 39 °C i inkubuj przez dwie godziny. Na koniec przenieś komórki do przygotowanej płytki 12-dołkowej zawierającej 1 ml medium MEM z dodatkiem 50 mM i 0,1 mg/ml cykloheksymidy i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 31 °C.

Aby uniknąć blaknięcia sygnału ekspresyjnego GFP, należy chronić preparaty przed światłem, owijając je folią aluminiową podczas wszystkich kolejnych procedur barwienia powierzchniowego. Umieścić szalkę hodowlaną z komórkami na metalowej płytce z lodem i przemyć. Raz zimnym PBS++, a następnie umieścić czysty kawałek paraformy na metalowej płytce z lodem i nanieść pipetą krople 30 µL przeciwciała rozpoznającego domenę zewnątrzkomórkową badanego białka.

Następnie należy położyć filtr zawierający komórki odwrócony stroną górną do dołu na kropli i dodać kilka kropli przeciwciała na tylną stronę filtra. Inkubować przez jedną godzinę na lodzie. Przemyć komórki trzy razy lodowatym PBS++ i utrwalić 3% paraformaldehydem przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie należy przemyć komórki raz roztworem PBS plus plus i inkubować w PBS plus plus przez pięć minut. Teraz inkubuj komórki w przepuszczalnym buforze blokującym. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, rozcieńczając przeciwciała pierwszorzędowe w stosunku 1:200 w BPB w celu wykrycia ekspresji RAB GTP ACE; wiruj przez 10 minut przy 13 000 RPM. Nanieś pipetą 30 µL roztworu przeciwciał na czystą laminkę umieszczoną w wilgotnej komorze.

Umieścić komórki na filtrze odwróconym do góry na kroplach przeciwciał i inkubować przez jedną godzinę. W temperaturze pokojowej umieścić komórki ponownie stroną górną do góry w płytce 12-dołkowej i przemyć pięć razy w ciągu 30 minut roztworem BPB w temperaturze pokojowej po inkubacji z odpowiednimi przeciwciałami wtórnymi, uwzględniając etap płukania.

Zanurz komórki na filtrze trzykrotnie w wodzie dejonizowanej, a następnie umieść filtr stroną górną do góry na mikropreparatach w 10 µL medium montażowego. Na wierzchu umieść szkiełko nakrywki o wymiarach 18 x 18 mm i za pomocą chusteczek delikatnie dociśnij szkiełko do komórek. Na koniec zabezpiecz krawędzie lakierem do paznokci. W przypadku pozornej infekcji samym plazmidem kodującym V-S-V-G-T-S-O 45 GFP białko jest dostarczane na powierzchnię podstawno-boczną dobrze spolaryzowanych komórek MDCK, co oceniono na podstawie czerwonego barwienia powierzchni w komórkach, które nie są dobrze spolaryzowane.

Część białka fuzyjnego GFP zostanie dostarczona do błony apikalnej. Jeśli próbki kontrolne wyglądają w ten sposób, dane nie są wiarygodne i eksperyment należy powtórzyć z użyciem lepiej spolaryzowanych komórek. Należy zauważyć, że nie całe białko fuzyjne GFP jest dostarczane do błony bazolateralnej podczas fazy pogoni w 31 °C, o czym świadczy rozległy wewnątrzkomórkowy sygnał zielony dla całkowitego białka. Po opanowaniu, technika ta powinna zająć około 10 do 12 godzin po jej opracowaniu.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny transportu błonowego do eksploracji białek regulacyjnych w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak ekspresować białka w spolaryzowanych komórkach nabłonkowych przy użyciu techniki mikroiniekcji.