Przestrzenno-czasowa manipulacja aktywnością małych GTPaz na poziomie subkomórkowym i w skali sekund w żywych komórkach

Niniejszy film demonstruje metodę, w której światło UV jest wykorzystywane do manipulowania aktywnością białka w błonie plazmatycznej. W tym celu komórki są współtransfected białkiem FRB zakotwiczonym w błonie oraz białkiem zainteresowania połączonym z FKBP. Do pożywki dodawany jest pochodna rapamycyny z fotoklatką.

Następnie podczas obrazowania żywych komórek światło UV jest kierowane na konkretny obszar komórki. Łącznik między rapamycyną a biotyną zostaje rozszczepiony, uwalniając chemiczny dimeryzator oraz produkt uboczny; uwolniony dimeryzator dyfunduje do wnętrza komórek i indukuje dimeryzację białka docelowego znakowanego FKBP oraz zakotwiczonego w błonie plazmatycznej białka FRB w obszarze napromieniowanym. Bez promieniowania UV białka FKBP i FRB nie wiążą się ze sobą, co skutkuje brakiem efektu.

Analiza danych wykazuje silnie zlokalizowaną rekrutację białka zainteresowania z fuzją FKBP na podstawie jego efektu fizjologicznego. Przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak podejście farmakologiczne i genetyczne, jest połączenie szybkości działania, specyficzności celu i rozdzielczości przestrzennej. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię przerzutów nowotworowych, które są następstwem migracji komórek rakowych.

W związku z tym manipulacja aktywnością kluczowych czynników migracji może ujawnić ich dokładny mechanizm molekularny, co jest warunkiem niezbędnym do wdrożenia odpowiedniego leczenia i terapii. Procedurę zaprezentują Chris Paul Meyer, doktorant, oraz Bob de Rose, technik z mojego laboratorium. Rozpocznij ten protokół, łącząc w sterylnej probówce do mikrocentryfugi następujące składniki: plazmid DNA, membranowo związany FRB, fluorescencyjnie znakowany FKBP, TIA one oraz wodę dejonizowaną; dodaj jeden mikrolitr a few gene HD do mieszaniny i wymieszaj w wstrząsarce typu vortex.

Inkubuj probówkę w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Podczas inkubacji dodaj 50 µL polilizyny do każdej studni szklanej komory ośmiostudniowej i inkubuj przez jedną minutę w celu pokrycia powierzchni, następnie odessaj roztwór i przemyj środek każdej studni 50 µL wody dejonizowanej. Następnie użyj trypsyny do 80-85% konfluencyjnych komórek NIH 3T3.

Po odklejeniu komórek należy dodać 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS, przenieść 375 µl zawiesiny do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 1 500 g przez trzy minuty. Po wirowaniu należy ostrożnie odessać medium. Następnie dodać 750 µl DMEM z 10% FVS i resuspenderować.

Resuspend osad, delikatnie pipetując zawartość w górę i w dół kilka razy. Następnie dodać zawiesinę komórkową do roztworu do transfekcji i, mieszając delikatnie końcówką pipety, przenieść 250 µL zawiesiny do transfekcji komórek do każdej studni komory. Wsunąć i inkubować.

37 °C przez 15 do 18 godzin. Aby zsyntezować klatkowy addukt rapamycyny z biotyną, należy zacząć od przygotowania 1 mM roztworu zapasu CRB w DMSO w sterylnej probówce do wirówki; w oddzielnej probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml rozpuścić 1 mg avadonu w 250 µl PBS.

Następnie należy sprzęgać grupę maskującą z rapamycyną. Do rozpuszczonego AVID dodać 0,5 µL roztworu zapasowego CRB, wymieszać poprzez kilkukrotne odwrócenie probówki, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Aby uzyskać koniugat CRB AVID, usunąć niezwiązane małe cząsteczki i oczyścić CRBA, należy zrównoważyć kolumnę do chromatografii wykluczania żelowego G 25 przy użyciu 300 µL PBS.

Powtórz czynność pięć razy po wyrównaniu kolumny. Nałóż 125 µL roztworu CRBA na centralną część łoża kolumny. Następnie odwiruj roztwór przez dwie minuty przy 800 ×g w temperaturze pokojowej, zbierając przelew do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL po transfekcji komórek.

Wymień medium na DMEM bez FBS, aby poddać komórki głodzeniu surowiczym, a następnie inkubuj przez 12 godzin. Po inkubacji delikatnie odessaj medium i dodaj 250 µL przygotowanego 1 µM roztworu CRBA. Następnie, aby zwizualizować dynamikę białek w żywych komórkach, użyj konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym z oświetleniem UV oraz sprzężoną optyką dla diody UV LED o długości fali 365 nm.

Przy użyciu światła fluorescencyjnego epi. Określ współrzędne i rozmiar plamki oświetleniowej, używając szklanej płytki powlekanej barwnikami fluorescencyjnymi wzbudzanymi światłem UV. Pozwala to na precyzyjne dostrojenie obszaru poddanego naświetlaniu.

Umieść szkiełko z komorą zawierające komórki na stoliku, używając obiektywu 100x i fluorescencji epifluorescencyjnej. Ustaw ostrość na komórki i znajdź pojedynczą komórkę. Przystąp do obrazowania komórek po ustaleniu poziomów tła efektu fizjologicznego.

W tym przypadku pomiar marszczenia błony (membrane ruffling) przeprowadzono poprzez naświetlanie światłem UV wybranego kwadrantu komórki, uwalniając w ten sposób zablokowaną rapamycynę, którą uprzednio rozpuszczono w DMSO, a następnie w PBS do stężenia końcowego 400 nanomolar. Do komory obrazowania dodano 100 mikrolitrów roztworu w celu wywołania efektów globalnych. Obrazy fluorescencyjne rejestrowano co 15 sekund przez 20 minut, aby ustalić, czy lokalna aktywacja białka RAC może indukować lokalne tworzenie się marszczeń.

Komórki NIH 3T3 zostały przetransfekowane FKbp aktywatorem RAC z tagiem YFP, TIA1 oraz zakotwiczonym w błonie LDR. Lokalnego naświetlania FRB na brzegu komórki, wskazanego żółtym okręgiem, towarzyszyło globalne naświetlanie lampą rtęciową przez jedną sekundę, rozpoczynając od 1063 sekundy. Jak widać tutaj, na początku niemal nie występowało marszczenie błony.

Jednakże, po lokalnym naświetlaniu, zaobserwowano przestrzennie ograniczone marszczenie po naświetlaniu globalnym i dodaniu rapamycyny, która powoduje translokację FK bp TIA one do błony komórkowej. Komórka wykazała globalną formację marszczeń, co wskazuje, że wcześniej zaobserwowana lokalna formacja marszczeń była spowodowana przestrzennie ograniczoną aktywacją rack. W celu przeprowadzenia analizy ilościowej komórki docelowe podzielono na cztery kwadranty i określono częstotliwość powstawania marszczeń w każdym kwadrancie po stymulacji lokalnej, jak i globalnej, co przedstawiono na tym wykresie.

Żadna z obserwowanych komórek nie wykazała tworzenia fałdów (ruffles) w obecności CRBA bez naświetlania UV lub przy lokalnym naświetlaniu UV, z dodatkiem lub bez dodatku Aden w medium sypkim. Jednakże, po dodaniu CRBA i przeprowadzeniu naświetlania UV, tworzenie fałdów zaobserwowano na podobnym poziomie, około 90% we wszystkich kwadrantach przy naświetlaniu globalnym; natomiast gdy naświetlano tylko kwadrant pierwszy, częstotliwość tworzenia fałdów wyniosła 100% w porównaniu do 30%, 25% i 30% w kwadrantach od drugiego do czwartego. Wyniki te wskazują, że lokalne odblokowanie (uncaging) rapamycyny może być wykorzystane do wywołania silnie zlokalizowanych efektów fizjologicznych w pojedynczej komórce.

W tym przypadku przedstawiono marszczenie błony wywołane aktywacją systemu rack. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak za pomocą światła uzyskać czasowo-przestrzenną kontrolę nad aktywnością małych białek GTPazy. Metoda ta może zostać zastosowana w każdym procesie fizjologicznym zależnym od translokacji specyficznych białek do błony plazmatycznej.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o tym, aby dla każdego badania przygotować świeże roztwory, odczynniki i komórki. Należy pamiętać, że praca z promieniowaniem UV może być niezwykle niebezpieczna, dlatego zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak okulary ochronne z filtrem UV.