Test śmierci komórek oparty na β-glukuronidazie (GUS)

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie systemu reporterowego Gus do analizy potencjalnych właściwości letalnych specyficznych genów. Geny zainteresowania są klonowane do kasety Gus i namnażane w odpowiednich wektorach agrobakteryjnych pod promotorem 35 s. Następnie wektory te są transformowane do szczepu Agrobacterium LBA 44 0 4, a następnie mieszane z kulturą zawierającą kasetę ekspresyjną Gus w celu infiltracji liści Nick Oceana Hamana.

Aktywność Gus można ocenić wizualnie poprzez barwienie histochemiczne lub ilościowo za pomocą fluorometrycznego pomiaru aktywności. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak drabinkowanie DNA czy test TUNEL, które są powszechnie stosowane w systemach ssaczych, lecz trudne do powtórzenia u roślin, jest to, że jest to czuły i szybki przejściowy test na roślinach, wykorzystujący prosty fakt, że do ekspresji gas niezbędne są żywe komórki. Procedura zostanie dziś zaprezentowana przez Hua RAOs.

Współpracownik naukowy na etapie postdoc w naszym laboratorium. Infiltracja wymaga w pełni rozwiniętych zdrowych liści roślinnicotiana hamana w wieku od trzech do sześciu tygodni, hodowanych w temperaturze 25 °C. Protokół należy zaplanować na osiem dni. Pierwszego dnia należy wykonać posiewy z banków w glicerolu agrobacterium tumor fassan zawierających wektory do testu śmierci komórek oraz wektor z kasetą ekspresyjną Gus; zawsze należy dołączyć pusty wektor jako kontrolę negatywną lub wypełniacz w przypadku testowania wielu kombinacji kultur.

Inkubuj płytki w temperaturze 28 °C przez dwa dni. Trzeciego dnia zaszczep 2 mL selektywnego podłoża LB pojedynczą kolonią z każdej płytki. Inkubuj każdą kulturę w warunkach wytrząsania w temperaturze 28 °C przez 24 h przy 200 RPM, aż do osiągnięcia maksymalnej gęstości wzrostu.

Po 24 godzinach inkubacji, w przypadku wystąpienia grudek, całkowicie resuspenduj kulturę poprzez pipetowanie, a następnie zwiększ całkowitą objętość każdej kultury do 10 mililitrów, dodając świeżą selektywną pożywkę LB, aby indukowane zostały geny wirulencji agrobacterium. Dodaj aceton do stężenia 25 micromolar i inkubuj każdą kulturę z wytrząsaniem w temperaturze 28 stopni Celsius przez kolejne 16 godzin. Następnym krokiem jest odwirowanie każdej kultury przy 4 000 Gs przez 10 minut w temperaturze pokojowej i resuspensja osadu w 10 mililitrach medium do infiltracji.

Nie dodawać acetonu, ponownie odwirować kultury, a następnie resuspender. Każdy osad zawiesić w pięciu mililitrach podłoża do infiltracji zawierającego 100 µM acetonu. Następnie zmierzyć OD przy 600 nm.

Dopuszczalne są stężenia tak niskie jak 0,1, jednak jeśli przekraczają one 0,9, należy rozcieńczyć je do 0,9 za pomocą medium infiltracyjnego i acetonu przed infiltracją. Po inkubacji ponownie inkubuj kultury w temperaturze 28 °C z wstrząsaniem przez trzy godziny. Wymieszaj kultury eksperymentalne i kontrolne w stosunku jeden do jednego z kulturą zawierającą kasetę Gus.

W przypadku każdej hodowli należy użyć strzykawki bezigłowej o pojemności 1 ml, aby przeprowadzić infiltrację w miejscu uszczelnienia ABA lub na spodniej stronie nowo powstających liści. Objętość infiltratu nie ma kluczowego znaczenia. Po uformowaniu się obszaru nasączonego wodą, należy przeprowadzić infiltrację kontroli negatywnej oraz badanego genu na przeciwległych liściach tej samej rośliny, a następnie w ten sam sposób zinfiltrować dwie kolejne rośliny.

W związku z tym dla każdej hodowli przygotowano rośliny w trzech powtórzeniach. Trzy dni po infiltracji nadszedł czas na zebranie liści i analizę ekspresji białka gust. Analizę histochemiczną należy rozpocząć od infiltracji próżniowej całego liścia substratem xlu, aż zostanie on całkowicie nasiąknięty.

Następnie inkubuj liście w ciemności w temperaturze pokojowej przez noc lub do momentu pojawienia się wyraźnego niebieskiego barwienia. Przepłucz liście wodą destylowaną i inkubuj je w 70% etanolu przez noc, aż do usunięcia chlorofilu. Następnego dnia opłucz liście wodą destylowaną i oceń poziomy ekspresji GUS.

Aby określić poziom ekspresji Gus, substrat mug jest przekształcany w fluorescencyjny produkt mu, który można zmierzyć. Procedurę rozpoczyna się od rozcierania zinfiltrowanych krążków liściowych w moździerzu przy użyciu ciekłego azotu. Następnie, utrzymując próbkę na lodzie, należy dodać 100 µL buforu do ekstrakcji GUS. Suspensję odwiruj w wirowarce przy 14 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C, a następnie zbierz nadsącz zawierający całkowite białka rozpuszczalne, w tym Gus.

Zmierz całkowite stężenie białek rozpuszczalnych za pomocą NanoDrop i dostosuj stężenie do 100 µg całkowitego białka dla każdej próbki w buforze ekstrakcyjnym Gus. Następnie do każdej próbki dodaj substrat mug w buforze ekstrakcyjnym Gus do stężenia końcowego 2 mM mug. Całkowita objętość 100 µL na próbkę powinna być wystarczająca; wymieszaj roztwór poprzez pipetowanie i inkubuj reakcję przez godzinę w temperaturze 37 °C.

Po godzinie reakcję zatrzymuje się poprzez dodanie 800 µL buforu stopującego GUS. Aby przeprowadzić kwantyfikację, 100 µL każdej próbki nanosi się na płytkę mikrotytrującą, którą analizuje się za pomocą czytnika płytek; mierzy się fluorescencję przy długości fali wzbudzenia 365 nm i emisji 455 nm, a następnie porównuje wyniki z krzywą wzorcową. Aktywność GUS można następnie podać jako jednostki mu na mikrogram całkowitego rozpuszczalnego białka na minutę reakcji. Wykrywa się różne poziomy GUS w zależności od użytego konstruktu, gdy kaseta ekspresyjna GUS jest współinfiltrowana z negatywnym regulatorem śmierci komórkowej lub genem przeciwśmierciowym.

W porównaniu obserwuje się wysokie poziomy Gus. Poziomy Gus w kontroli z pustym wektorem są znacznie niższe. I odwrotnie, gdy zastosowany zostanie pozytywny regulator śmierci komórkowej lub gen proapoptotyczny, obserwuje się wyraźny spadek ekspresji Gus w porównaniu do kontroli z pustym wektorem.

Po opanowaniu, technika ta może zostać wykonana w ciągu około jednego tygodnia. Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że technika ta służy jako krok wstępny do określenia potencjału specyficznych genów. Niezbędne są dodatkowe prace w celu potwierdzenia tych wstępnych wyników oraz określenia rodzaju zaangażowanych komórek.