Ograniczenie kaloryczne na stałym podłożu u Caenorhabditis elegans

Procedura polega na zastosowaniu ograniczenia kalorycznego w standardowych warunkach hodowli na płytkach z pożywką sea elegance w celu zbadania jego wpływu na długowieczność, reprodukcję i metabolizm. Jest to realizowane poprzez dokładny pomiar stężenia bakterii, które będą służyć jako źródło pokarmu. Drugim krokiem procedury jest odpowiednie rozcieńczenie hodowli bakterii do właściwych stężeń.

Następnie przygotuj podłoża SDR z martwymi bakteriami. Na koniec przeprowadź eksperymenty SDR z populacją nicieni o zsynchronizowanym wieku. Wyniki pomiarów produkcji potomstwa i długości życia mogą wykazać opóźnioną i zredukowaną produkcję potomstwa oraz wydłużoną średnią długość życia.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do metod takich jak Dian w medium AZA, jest to, że cały eksperyment zostanie przeprowadzony na standardowej płytce z agarem AGA, stosowanej w większości laboratoriów badających organizmy ciepłolubne. W przypadku eksperymentów z restrykcją dietetyczną należy sporządzić oddzielne krzywe kalibracyjne dla każdego szczepu bakterii wykorzystywanego jako źródło pożywienia. Pobierz pojedynczą kolonię bakterii e coli OP 50 ze świeżego wysiewu na agar LB i zaszczep trzy mililitry płynnej kultury w bulionie LB w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez noc. Przygotuj seryjne dwukrotne rozcieńczenia kultury z nocnej inkubacji.

Następnie zmierz absorbancję każdego rozcieńczenia przy 600 nanometrach za pomocą spektrofotometru w trzech powtórzeniach. Dalsze rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej wykonaj w stopniu milionkrotnym, a następnie równomiernie wysej 0,4 mililitra zawiesiny bakteryjnej z każdego rozcieńczenia na płytkę LB agar o średnicy 100 milimetrów i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 18 do 24 godzin. Policz liczbę kolonii bakteryjnych wyrosłych na każdej płytce, aby obliczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr dla każdej próbki.

Następnie narysuj wykres OD 600 jako funkcji stężenia bakterii i przeprowadź analizę regresji liniowej, aby ustalić zależność między zmierzonymi wartościami OD 600 a stężeniami bakterii OP 50. W tej metodzie w warunkach karmienia ad libitum stosuje się stężenie bakterii wynoszące 1 × 10¹¹ CFUs na mililitr, a w optymalnych warunkach karmienia DR – 1 × 10⁸ CFU na mililitr. Jednak do ustalenia pełnej zależności od dawki może być konieczne zastosowanie od czterech do sześciu różnych stężeń bakterii.

W celu przeprowadzenia SDR i analizy odpowiedzi. Przygotuj inokulum z pojedynczej kolonii bakterii e coli OP 50 w 3 ml płynnej pożywki LB, inkubując w wytrząsarku w temperaturze 37 °C przez sześć do ośmiu godzin. Przenieś kulturę OP 50 do nowej kolby zawierającej 500 ml pożywki LB i hoduj przez noc, aby bakterie osiągnęły nasycenie, jeśli jest to konieczne.

Przygotować odpowiednie rozcieńczenie kultury OP 50 do pomiaru absorbancji przy OD 600. Aby określić stężenie bakterii, należy je zgranulować poprzez wirowanie przy 1500 Gs przez 20 minut. Usunąć nadosad i resuspendować bakterie do stężenia 1 × 10¹² CFUs na mililitr.

Następnie przygotuj kultury bakterii o objętości 10 mililitrów w sześciu różnych stężeniach, w zakresie od 1 × 10¹² do 1 × 10⁷ CFU na mililitr. Nanieś 0,2 mililitra kultury bakterii na środek zestalonej płytki NGM o średnicy 60 milimetrów. Unikaj dotykania końcówką pipety powierzchni płytki, ponieważ nacięcia na powierzchni umożliwiają nicieniom przekopanie się do agaru.

Umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na jedną godzinę. Następnie nanieś na każdą płytkę 10 µL carbonic soin o stężeniu 100 mg/mL oraz 10 µL canmycyny o stężeniu 50 mg/mL, aby zahamować wzrost bakterii. Przechowuj płytki z różnymi stężeniami antybiotyku i zabitymi bakteriami w temperaturze 4 °C do późniejszego wykorzystania przez okres do jednego miesiąca.

Ważne jest, aby przygotować i przechowywać odpowiednią liczbę płytek, najlepiej z tej samej serii dla całej rośliny. Przeprowadź eksperyment z co najmniej jednodniowym lub dwudniowym wyprzedzeniem, aby zweryfikować żywotność bakterii. Zeskrob niewielką ilość bakterii z płytek SDR i wysiej ją na pustą płytkę N GM z karbonikiem, seiną i antymycyną.

Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na sześć do ośmiu godzin i potwierdź brak wzrostu bakterii. W większości badań związanych z SDR, takich jak analiza długości życia i profilowanie produkcji potomstwa, niezbędne jest przygotowanie populacji nicieni zsynchronizowanych pod względem wieku. Użyj platynowego picker-a do nicieni, aby przenieść 20 do 30 reprodukcyjnie aktywnych osobników dorosłych na kilka zwykłych płytek NGM.

Z użyciem szczepu OP 50. W zależności od liczby jaj wymaganych do eksperymentów, może być konieczne użycie większej liczby osobników dorosłych. Pozostawić płytki w temperaturze 20 °C przez cztery godziny, aby umożliwić składanie jaj.

Usuń osobniki dorosłe z szalki i sprawdź wizualnie, czy na szalkach znajdują się jaja. Kontynuuj inkubację szalek w temperaturze 20°C, aby potomstwo mogło rozwinąć się do późnego stadium L4 lub pierwszego dnia stadium dorosłego. W przypadku nicieni N2 typu dzikiego w temperaturze 20°C zwykle trwa to trzy dni.

Do analizy długości życia. Przenieś od 10 do 12 jednodniowych dorosłych nicieni na płytkę SDR, aby rozpocząć restrykcję dietetyczną. W celu uzyskania odpowiedniej mocy statystycznej użyj łącznie od 60 do 100 nicieni dla każdego wariantu SDR.

Oceniaj żywotność każdego nicienia co dwa do trzech dni, aż do śmierci wszystkich osobników. Ważne jest, aby co drugi dzień przenosić nicienie na świeże płytki SDR, aby zapobiec ich zagłodzeniu. Ta krzywa kalibracyjna przedstawia stężenie OP 50 w zależności od OD 600.

Równanie wyznaczone za pomocą analizy regresji liniowej może być wykorzystywane do wszystkich przyszłych obliczeń stężeń bakterii OP 50. W niniejszym badaniu analizuje się wpływ przewlekłych zabiegów SDR na średnią długość życia różnych szczepów nicieni w porównaniu z normalną odpowiedzią zależną od dawki nicieni typu dzikiego na SDR. Efekt przedłużenia długości życia indukowany przez SDR jest częściowo tłumiony przez nadekspresję DR dwa, podczas gdy mutacja DAF 16 MU 86 nie wpływa na wydłużenie długości życia indukowane przez SDR.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat przeprowadzania Dian w standardowej grze opartej na AGA w sea elegance.