Przesiewanie wysokoprzepustowe i biosensing z wykorzystaniem fluorescencyjnych szczepów C. elegans

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę hodowli i dyspensowania fluorescencyjnych szczepów CL gans w celu wysokoprzepustowego przesiewu bibliotek chemicznych lub wykrywania zanieczyszczeń środowiskowych, aby ocenić wpływ czynników chemicznych lub środowiskowych na aktywność konkretnych białek. W przypadku CL elgan, w pierwszej kolejności przygotowywane są kultury bakteryjne służące jako pożywka dla nicieni, a następnie hodowane są zsynchronizowane nicienie transgeniczne GFP.

Następnie zbiera się od 0,5 do 2 milionów nicieni, które są przemywane i rozdzielane do trzech 84-dołkowych płytek mikrotitracyjnych, a następnie do nicieni dodaje się małe cząsteczki z biblioteki chemicznej lub próbki testowe, takie jak woda, żywność lub gleba. Na koniec fluorescencję nicieni pomiar za pomocą czytnika mikropłytek.

Analiza danych dotyczących intensywności fluorescencji pozwala na wykrycie małych cząsteczek modulujących indukowalne ścieżki transkrypcyjne lub umożliwia detekcję zanieczyszczeń środowiskowych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak testy in vitro oraz testy oparte na hodowlach komórkowych, jest uniknięcie marnowania czasu na związki, które są toksyczne lub nieaktywne in vivo. Ta wysokoprzepustowa metoda może pomóc w identyfikacji małych cząsteczek modulujących różnorodne ścieżki indukowalne.

Chociaż opracowaliśmy tę metodę do wysokoprzepustowego przesiewania bibliotek małych cząsteczek, można ją również zastosować w biosensingu zanieczyszczeń w próbkach żywności i środowiska. Procedurę zaprezentują Andrew Dine, technik w moim laboratorium, oraz Q long, postdoc w moim laboratorium. Należy wcześniej przygotować pożywkę bakteryjną dla nicieni.

Rozpocznij od zaszczepienia 500 mililitrów pożywki Terrific Broth, uzupełnionej o 50 mikrogramów na mililitr streptomycyny, pięcioma mililitrami nasyconej kultury e coli OP 50. Umieść kulturę na inkubatorze z wytrząsaniem i hoduj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia podziel kulturę do 10 probówek o pojemności 50 mililitrów. Następnie umieść probówki w wirówce chłodzącej i wirowuj przy 2 500 RCF przez 20 minut. Po wirowaniu resuspenduj każdy osad bakteryjny w 10 mililitrach płynnej pożywki do wzrostu nicieni lub NGM.

Wstrząsaj zawiesiny w poziomie. Użyj inkubatora z wytrząsaniem przez 15 minut w celu resuspensji bakterii. Następnie odwiruj kulturę bakteryjną z prędkością 2,500 RCF w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.

Odlej pożywkę NGM i zważ osad bakteryjny. Następnie dodaj równą objętość buforu NGM i resuspenduj osad za pomocą wortexa. Na koniec przelej po 3 ml resuspendowanej kultury bakteryjnej do probówek o pojemności 15 ml i przechowuj je w temperaturze -20 °C do momentu użycia.

W niniejszej demonstracji, jako przykład, zostanie zmierzony wpływ indukującego stres czynnika Xeno Duke loan na czynnik transkrypcyjny Sskn one. Sskn one jest znany z aktywowania genów cytoprotekcyjnych podczas stresu oksydacyjnego i ksenobiotycznego. Przygotowana zostaje wielkoskalowa hodowla linii Trenchgenic c gans VP 5 96, która niesie dwie konstrukty fluorescencyjne.

Nicienie VP 5 96 wykazują ekspresję zarówno promotora GST-4 napędzającego GFP, który jest wykorzystywany do monitorowania aktywności czynnika transkrypcyjnego Sskn-1, jak i promotora DOP-3 napędzającego RFP, który służy jako standard do normalizacji liczby nicieni.

DOP three jest promotorem receptora dopaminy i jest konstytutywnie ekspresjonowany w neuronach w całym organizmie. W przykładzie, biorąc pod uwagę, że ksenobion silnie aktywuje sskn one i zwiększa ilość GFP ekspresjonowanej z promotora GS T four, aby przygotować hodowle, należy rozpocząć od połączenia 150 milliliters buforu N NGM, 1.5 milliliters LB, 150 microliters 1 molar cholesterolu oraz 75 microliters Streptomycyny o stężeniu 100 milligrams per milliliter. Dodanie LB pomaga zapobiegać przywieraniu nicieni do szkła i plastiku, lecz ilość ta jest niewystarczająca do wspierania wzrostu bakterii.

Przefiltruj mieszaninę w celu sterylizacji, a następnie przelej ją do sterylnej kolby o pojemności jednego litra i odstaw kolbę, aby umożliwić uwolnienie jaj z dorosłych nicieni GR. Usuń bakterie z nicieni poprzez wirowanie i wymianę pożywki NGM, aż nadsącz stanie się klarowny. Przemyj nicienie po raz drugi, zawieszając je w sterylnej wodzie, a następnie ponownie odwiruj.

Usunąć nadsadzinę i napełnić probówkę 3,75 mililitrów sterylnej wody. Dodać jeden mililitr domowego wybielacza oraz 250 mikrolitrów 10 N wodorotlenku sodu i natychmiast wymieszać poprzez odwrócenie probówki pięć do sześciu razy. Umieścić probówkę w rotatorze po tym, jak nicienie były eksponowane na działanie wybielacza przez cztery minuty.

Umieść probówkę pod stereomikroskopem. Większość osobników dorosłych powinna ulec lizie. Energicznie wstrząśnij probówką 15 do 20 razy, aby pomóc w lizie pozostałych nicieni dorosłych; po upływie łącznie pięciu minut dodaj wodę sterylną, aż probówka będzie pełna.

Wymieszaj metodą inwersji od pięciu do sześciu razy, aby zebrać jaja. Wirowarkuj probówkę przez jedną minutę przy 500 RCF. Przemyj jaja trzykrotnie, zawieszając je w 10 mililitrach sterylnej wody, wirowarkując i usuwając nadsącz.

Następnie rozcieńcz 100 µL próbkę jaj 100-krotnie, dodając 10 mL buforu NGM. Potem nanieś pipetą trzy alikwoty po 5 µL na pokrywkę szalki Petriego pod mikroskopem. Policz liczbę jaj w trzech oddzielnych alikwotach po 5 µL.

Aby oszacować całkowitą liczbę jaj, należy dodać od 200 000 do 2 milionów jaj do kolby z buforem NGM i inkubować kulturę przy 100 RPM w temperaturze 20 °C. Po upływie co najmniej 16 godzin od dodania jaj do kolby, należy za pomocą sterylnej pipety serologicznej pobrać około 0,5 ml zawiesiny kultury nicieni.

Nanieś pipetą trzy krople po 5 µL na sterylną pokrywkę szalki Petriego. Umieść pokrywkę w zamrażarce w temperaturze -20 °C na jedną do dwóch minut w celu sparaliżowania nicieni. Po sparaliżowaniu nicieni oblicz średnią liczbę żywych, wyklutych osobników w 5 µL za pomocą stereomikroskopu, aby oszacować ich całkowitą liczbę.

Rozmrozić wcześniej przygotowaną mrożoną kulturę bakterii OP 50, pozostawiając ją na blacie przez kilka minut. Następnie dodać 3 mL 50% OP 50 na 500 000 wyklutych nicieni. Inkubować kolbę w wytrząsarce przy 100 RPM w temperaturze 20 °C.

Robaki rozwiną się do stadium larw L4 oraz młodych osobników dorosłych w ciągu około 51 godzin. Przez cały okres inkubacji należy monitorować ilość bakterii poprzez inspekcję wizualną. W przypadku przejaśnienia się pożywki należy dodać więcej bakterii.

Za pomocą sterylnej pipety serologicznej przenieś około 0.5 milliliters zawiesiny kultury nicieni na standardową płytkę z agarem NGM. Obejrzyj nicienie pod mikroskopem stereoskopowym, aby upewnić się, że większość z nich to larwy L4 i młode dorosłe osobniki; w mikroskopii w świetle przechodzącym larwy L4 będą miały jasną plamkę brzuszną w środkowej części ciała. Młode dorosłe osobniki będą nieco większe i nie będą miały jasnej plamki.

Następnie przenieś kulturę nicieni do sterylnych probówek o pojemności 50 ml. Umieść probówki w statywie w komorze z laminarnym przepływem powietrza i odstaw je, aby nieuwylęgłe jaja lub nicienie, które nie rozwinęły się, opadły na dno. Opadają one wolniej niż rozwinięte nicienie.

Po 10 minutach usuń nadsącz zawierający nieowładnięte i nierozwinięte nicienie poprzez aspirację, dodając około 10 mililitrów buforu NGM do każdego osadu, a następnie zawieś nicienie, delikatnie obracając probówkami. Zbierz wszystkie nicienie do jednej probówki o pojemności 50 mililitrów. Wirowarką z koszyczkami wahadłowymi odwiruj próbkę przy 500 RCF przez 30 sekund.

Następnie resuspenduj nicienie w 50 ml NGM z 1% LB w celu ich wypłukania. Powtórz tę czynność, płucząc je trzy do czterech razy, aby usunąć bakterie po przemyciu. Napełnij probówkę buforem NGM plus LB do objętości 50 ml.

Przelej tę zawiesinę do specjalnej kolby do dozowania nicieni z mieszadełkiem magnetycznym i ustaw ją na mieszadle magnetycznym. Aby wypełnić przestrzeń martwą w kolbie dozującej i kasecie dozownika, wymagana jest objętość co najmniej 20 milliliters lub 60 000 nicieni. Policz liczbę nicieni w trzech kroplach o objętości five microliter, zgodnie z wcześniej przedstawioną procedurą.

Po przeliczeniu na podłożu NGM z dodatkiem LB do stężenia od 12 do 15 nicieni na pięciomikrolitrową kroplę, każda płytka 384-dołkowa wymaga około 35 000 nicieni lub 11,5 ml zawiesiny nicieni. Włóż kasetę dozującą 10 µL do dozownika i wysterylizuj ją poprzez przepłukanie 70% etanolem. Usuń etanol, przepłukując urządzenie wodą sterylną.

Wprowadź koniec kasety dozującej do kolby tak, aby znajdował się tuż nad mieszadłem magnetycznym, nie zakłócając jego ruchu. Upewnij się, że nicienie pozostają w zawiesinie w całej objętości kolby. Zaprogramuj dozownik tak, aby dozował nicienie z niską prędkością, stosując dwa wstępne impulsy przygotowawcze i uruchamiając przepływ co najmniej 10 milliliters zawiesiny nicieni.

Szybko napełnij płytki mikrotitracyjne, które powinny już zawierać związki testowe, aby zapobiec osadzaniu się nicieni w rurkach. Na tym etapie należy wykorzystać związki testowe uprzednio naniesione na płytkę mikrotitracyjną. Glow. Uszczelnij płytki przepuszczalną taśmą, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu w dołkach.

Umieść płytki na platformie wytrząsowej w inkubatorze w temperaturze odpowiedniej dla danego testu. Nie układaj płytek w stosach, ponieważ może to ograniczyć przepływ powietrza. Umieść docelową płytkę w czytniku mikropłytek, aby zmierzyć intensywność fluorescencji w każdej studzince przy zastosowaniu odpowiednich długości fal emisji i pobudzenia.

Filtry używane dla GFP to wzbudzenie przy 485 i emisja przy 528. Filtry dla RFP to wzbudzenie przy 540 i emisja przy 590. Po odczycie płytki oblicz stosunek GFP do RFP i znormalizuj go względem odczytów z dołków kontrolnych, które nie zawierają związku aktywującego, aby określić dokładną krotność różnicy w intensywności fluorescencji wynikającej z poszczególnych zabiegów.

Przedstawiony tutaj test SSKN wykorzystuje reporter podwójny zintegrowany z chromosomem, a szczep, w którym nicienie były liczone ręcznie przy użyciu mikroskopu stereoskopowego. Liczba nicieni korelowała z dozowaną objętością z wartością R kwadrat wynoszącą 0,94 i wartością p mniejszą niż 0,0001. Wskazuje to, że liczbę nicieni dozowanych do każdego dołka można kontrolować poprzez regulację dozowanej objętości.

Całkowita fluorescencja GFP na dołek pokazana po lewej stronie oraz fluorescencja RFP na dołek pokazana po prawej stronie są wysoce powtarzalne pomiędzy dołkami na płytce 384-dołkowej na tych rysunkach. Oś X wskazuje względną fluorescencję zmierzoną w każdym dołku. Linie ciągłe reprezentują średnie, a linie przerywane trzy odchylenia standardowe powyżej lub poniżej średniej fluorescencji wszystkich dołków, przy współczynniku zmienności poniżej 9%. Jak pokazano na tym rysunku, fluorescencja GFP z promotora GST4 jest liniowo skorelowana z fluorescencją RFP z promotora DOP3 w 384 dołkach, przy wartości R kwadrat wynoszącej 0,62 i wartości p mniejszej niż 0,0001.

W związku z tym nieindukowalny reporter RFP może zostać wykorzystany do normalizacji indukowalnego reportera GFP. Dzięki temu stosunek fluorescencji GFP do RFP staje się wysoce powtarzalny pomiędzy poszczególnymi studzienkami w całej płytce 384-dołkowej.

Obliczenie stosunku GFP do RFP zredukowało współczynnik zmienności do poziomu poniżej 6%, co demonstruje zdolność reportera RFP z promotorem DOP trzy do zmniejszenia zmienności, jak pokazano tutaj. Indukcja GFP względem RFP przy użyciu aktywującego ksenobiotyku SK N one jest silna i wysoce powtarzalna w całej płytce 384-dołkowej; średnie względne stosunki fluorescencji dla wszystkich dołków kontrolnych oraz dlo są zaznaczone liniami ciągłymi. Trzy odchylenia standardowe powyżej średniej kontrolnej i poniżej średniej dlo są zaznaczone liniami przerywanymi.

Po opanowaniu metody, założenie hodowli nicieni zajmuje około jednej godziny pierwszego dnia, a ich zbieranie i dozowanie można przeprowadzić w około dwie godziny, jeśli proces zostanie wykonany prawidłowo. Podczas próby zastosowania tej procedury ważne jest, aby zacząć od co najmniej 60 000 nicieni i utrzymywać je w zawiesinie podczas dozowania. Po opracowaniu tej metody, zgodnie z opisaną procedurą, można przeprowadzić przesiewy w celu wykrycia, na przykład, sekwencji raportowych dla innych szlaków indukowalnych, aby opracować modulatory dla pozostałych szlaków.

Technika ta może utorować drogę badaczom z dziedzin wysokoprzepustowych badań przesiewowych oraz biosensorów do szybkiej identyfikacji modulatorów szlaków małocząsteczkowych lub wykrywania zanieczyszczeń środowiskowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak hodować, dozować i mierzyć fluorescencyjne szczepy elegans w celu wysokoprzepustowego przesiewania indukowalnych szlaków transkrypcyjnych lub testowania wielu próbek pod kątem zanieczyszczeń środowiskowych.