Wykrywanie tlenku azotu i anionoradykału ponadtlenkowego w komórkach za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego z użyciem pułapek spinowych

Nazywam się Frederick Dina i jestem profesorem nadzwyczajnym farmakologii na The Ohio State University. W tej demonstracji przedstawimy metodę wykrywania tlenku azotu oraz anionorodnika ponadtlenkowego w komórkach z wykorzystaniem EPR i pułapkownictwa spinowego.

Reaktywne formy tlenu i azotu są zaangażowane w rozwój wielu chorób, dlatego ich detekcja w układach biologicznych ma kluczowe znaczenie. W układach biologicznych stosuje się niewiele wiarygodnych metod wykrywania form reaktywnych, a są one ograniczone pod względem swoistości i czułości. Powszechnie stosowaną metodą identyfikacji ROS jest jednak pułapkowanie spinowe, które polega na reakcji addycji rodnika do nitro-pułapki spinowej lub kompleksów metali, w wyniku czego powstaje trwały addukt spinowy, który można wykryć za pomocą spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR). Różne addukty rodnikowe wykazują charakterystyczne widma, które mogą być wykorzystane do identyfikacji generowanych rodników i mogą dostarczyć wielu informacji na temat natury i kinetyki powstawania rodników.

Syntaza tlenku azotu katalizuje przekształcenie L-argininy w L-cytrulinę przy użyciu N-A-D-P-H w celu wytworzenia tlenku azotu. W warunkach stresu oksydacyjnego eNOS może przejść z produkcji tlenku azotu na produkcję anionorodnika ponadtlenkowego w procesie zwanym rozprzęganiem, który prawdopodobnie jest wywoływany przez utlenianie hemu lub kofaktora, który przenosi tlenek azotu. Regulacja poziomu tlenku azotu w układach biologicznych jest istotna, ponieważ odgrywa on krytyczną rolę w sygnalizacji komórkowej, prowadząc do korzystnych funkcji fizjologicznych, takich jak wazodylatacja, jednak jego nadprodukcja jest często powiązana ze stanami zapalnymi. Dlatego detekcja tlenku azotu w układach biologicznych jest ważna.

Inną ważną klasą cząsteczek sygnałowych w systemach biologicznych są reaktywne formy tlenu, takie jak tlenek azotu. Reaktywne formy tlenu w niskich stężeniach odgrywają istotną rolę w regulacji funkcji komórek, sygnalizacji i odpowiedzi immunologicznej, jednak w niekontrolowanych stężeniach mogą prowadzić do komórkowych uszkodzeń oksydacyjnych, skutkujących stresem oksydacyjnym. Rodnik anionowy ponadtlenkowy jest jedną z najważniejszych reaktywnych form tlenu i stanowi główny prekursor niektórych z najsilniej utleniających gatunków znanych w systemach biologicznych, takich jak nadtlenek azotanowy i rodnik hydroksylowy. Detekcja i lub sekwestracja ponadtlenku w systemie biologicznym jest zatem istotna, ponieważ jego generowanie stanowi pierwszy sygnał wybuchu oksydacyjnego przed jego pełnym rozpoczęciem.

Niniejszy protokół opisuje trypsynizację hodowanych komórek śródbłonka aorty bydlęcej zgodnie z procedurą opisaną w tekście. Przenieść komórki na oznakowaną płytkę 6-dołkową i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 po zakończeniu inkubacji.

Wyjmij płytkę sześciodołkową z inkubatora i odessij medium z pierwszego dołka. Przemyj komórki dwukrotnie 1 mL buforu fosforanowo-solnego w dwuwodnym roztworze (DPBS). Przygotuj 1,9 mM roztwór siarczanu żelaza(II) siedmiowodnego, dodając 0,8 mg siarczanu żelaza do 1 mL DPBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu.

Następnie należy przygotować roztwór MGD, dodając 2,7 mg MGD amonu do 500 µL DPBS z chlorkiem wapnia i chlorkiem magnezu. Dodać 210 µL świeżo przygotowanego 1,9 mM siarczanu żelaza(II) siedmiowodny oraz 210 µL świeżo przygotowanego MGD, zachowując stosunek molowy 1:7, a następnie wymieszać otrzymaną zawiesinę. Dodać 4,6 µL jonów wapnia IV i ponownie wymieszać roztwór, pipetując go w górę i w dół.

Następnie inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 36 minut. Zebrać supernat do probówki typu Eppendorf. Wprowadzić parametry akwizycji EPR: pole centrum 34,27 G, amplitudę modulacji 6 G oraz częstotliwość 9,8 GHz.

Ponieważ parametry różnią się w zależności od urządzenia i warunków eksperymentalnych, należy zapoznać się z tekstem w celu sprawdzenia innych parametrów stosowanych w tym sprzęcie. Przenieść nadsącz do płaskiej celi EPR, uszczelnić parafiną i umieścić w kawności EPR. Po uruchomieniu eksperymentu zarejestrować widma przez około 21 minut przy 121 skanach i 10,4 sekundach na skan.

Użyj oprogramowania do przetwarzania danych Bruker WIN EPR w celu korekcji linii bazowej i całkowania widm 2D, co pozwala na zredukowanie szumu tła. Należy zauważyć, że czas skanowania oraz liczba skanów mogą różnić się w zależności od eksperymentu. Ponadto metody korekcji linii bazowej mogą być różne w zależności od stosowanego oprogramowania.

Aby rozpocząć rozsprzęganie Enos, należy usunąć medium z drugiej studni płytki sześciodołkowej i przemyć komórki dwukrotnie 1 mL DPBS. Następnie należy dodać 100 µL przygotowanego 0,5 mM roztworu Syn one i uzupełnić objętość do 2 mL za pomocą DPBS zawierającego 10% FBS. Komórki należy inkubować przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po inkubacji.

Przemyj komórki dwukrotnie DPBS. Następnie dodaj 210 µL świeżo przygotowanego siarczanu żelaza(II) siedmiowodnego o stężeniu 2,8 mM oraz 210 µL świeżo przygotowanego MGD o stężeniu 19,6 mM, zgodnie z poprzednią procedurą. Następnie dodaj 4,6 µL jonów wapnia o stężeniu 1,9 mM i ponownie wymieszaj roztwór.

Podobnie jak poprzednio, inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 36 minut. Po 36 minutach zbierz supernatant osadzający się w probówce typu Eppendorf i przenieś go do płaskiej kuwety EPR. Zarejestruj widma EPR, stosując te same parametry akwizycji co poprzednio, zgodnie z procedurą pozyskiwania danych.

Przetworzyć dane w ten sam sposób przed rozpoczęciem niniejszego protokołu. Przygotować roztwór zapasowy 1 M DMPO oraz PBS zawierający 0,1 mM DTPA. Następnie przygotować roztwór 1 mg/ml w płycie 4x12.

Przygotować alikwoty po 1 ml roztworu zapasowego PMA (octan mirystanu PMA) w DMSO, rozcieńczając go do stężenia 10 µg/ml w PBS w probówce typu Eppendorf zawierającej 1 mg/ml D-glukozy oraz 1 mg/ml albuminy. Przygotować zawiesinę PMN o stężeniu od 5 do 6 milionów komórek na ml, pipetując w górę i w dół w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Przygotować mieszaninę o końcowej objętości 60 µl zawierającą około 1,6 × 10⁶ komórek PMN, 10 mM DMPO oraz 0,2 µg/ml PMA.

W tym doświadczeniu będziemy korzystać ze spektrometru pasma X Bruker ESP 300. Przenieś roztwór do płaskiej celi EPR, a następnie umieść celę w rezonatorze EPR. Wprowadź parametry akwizycji EPR: pole centralne 3,486 goss, amplitudę modulacji 0,5 goss oraz częstotliwość 9,8 gigahertz.

Ponieważ parametry będą różnić się w zależności od instrumentu oraz warunków eksperymentalnych, prosimy zapoznać się z tekstem w celu sprawdzenia pozostałych parametrów wykorzystanych w tym doświadczeniu podczas pozyskiwania widm. W niniejszym pokazie prezentujemy detekcję tlenku azotu i rodników nadtlenkowych SU przy użyciu dwóch różnych pułapek spinowych: żelazowego MGD oraz DNPO.

Wykazujemy, że stymulacja komórek śródbłonka jonami wapnia wywołuje produkcję tlenku azotu, a zastosowanie donora azotynów może tę produkcję zmniejszyć. Jednakże stymulacja neutrofili PMA w obecności pułapki spinowej nitro daje rodnik hydroksylowy ADDA zamiast tlenku S ze względu na niestabilność początkowo powstałego adduktu ponadtlenkowego. Choć mechanizmy pułapkowania spinowego przez iron MGD nitros są zasadniczo takie same, addycja tlenku azotu do iron MGD charakteryzuje się szybkim tempem reakcji, a powstała forma adduktu tlenku azotu z iron MGD jest bardzo stabilna.

W rzeczywistości można zamrozić roztwór w temperaturze -80 °C w celu późniejszego zarejestrowania widma EPR bez znaczącego spadku intensywności sygnału EPR. Z drugiej strony detekcja tlenku przy użyciu pułapki spinowej nitro jest powolna, co wymaga zastosowania wyższych stężeń pułapki spinowej w porównaniu do odpowiednika MGD 4 dla detekcji tlenku azotu.

W celu skutecznego wykrycia formy adduktu ponadtlenkowego zastosowano kilka podejść, których nie demonstrowaliśmy już w tym filmie. Przykładowo, użycie płaskiej kuwety może zapewnić lepszą intensywność sygnału adduktu ponadtlenkowego dzięki wyższej gęstości komórek. Zachęcam do zapoznania się z tekstem w tej kwestii.

Ponadto, zamiast stosować DMPO, można użyć certyfikowanej pułapki spinowej, takiej jak BMPO i VMP lub fosforylowany Nitro DAP MPO, które mogą dawać trwalsze addukty nadtlenku SU. W celu stabilizacji adduktów nadtlenku SU przy zastosowaniu pułapkowania spinowego do detekcji US wykorzystano również cyklodekstrynę. Wysoce zaleca się niezwłoczne zarejestrowanie widma EP po wygenerowaniu nadtlenku SU.

W związku z tym detekcja tlenku azotu przy użyciu MGD żelaza jest znacznie bardziej wydajna, a głównym wyzwaniem stojącym obecnie przed pułapkowaniem spinowym anionorodnika ponadtlenkowego metodą EPR jest osiągnięcie charakterystyk obserwowanych podczas tworzenia adduktu tlenku azotu z MGD żelaza. Chodzi o szybką reaktywność z anionorodnikiem ponadtlenkowym oraz tworzenie stabilnych adduktów. Obecnie w naszym laboratorium, a także w innych grupach badawczych, prowadzone są prace nad opracowaniem pułapek spinowych o wysokiej reaktywności wobec anionorodnika ponadtlenkowego, które prowadziłyby do powstawania stabilnych adduktów spinowych.