Mozaikowa analiza funkcji genów w postnatalnym rozwoju mózgu myszy z wykorzystaniem rekombinacji Cre opartej na wirusach

Ogólnym celem niniejszej procedury jest manipulacja funkcją genów w okresie postnatalnym rozwoju mózgu. Osiąga się to poprzez wybór i przygotowanie odpowiednich wirusów, ich nabranie do strzykawki oraz przygotowanie sprzętu do iniekcji. Następnie wirus jest wstrzykiwany do mózgów noworodków myszy, a ostatnim krokiem jest uśmiercenie zwierząt i obrazowanie wstrzykniętych obszarów.

W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące różnicowe znakowanie komórek kontrolnych i knockoutowych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuronauki, takie jak sposób genetycznej regulacji okresu rozwoju ponatalnego. Do iniekcji można zastosować komercyjnie dostępny roztwór wirusa adeno-zależnego o pełnym mianie, zazwyczaj 10¹² kopii genomu na ml, aby zmanipulować dużą liczbę komórek.

Jeśli pożądane jest rzadkie oznakowanie, należy zacząć od rozcieńczenia 1:10. Po rozmrożeniu wirusa na lodzie, natychmiast przenieść objętość do wstępnego rozcieńczenia do sterylnej probówki PCR o pojemności 250 µL. Rozcieńczenie należy przechowywać na lodzie.

Przygotuj pompę wtryskową, wybierając odpowiednią strzykawkę i podłączając ją do igły do załadunku. Następnie ostrożnie pobierz roztwór wirusa, aż w strzykawce pojawi się bardzo mały pęcherzyk powietrza; aby ułatwić ten etap, można zastosować obojętny barwnik do załadunku. Teraz zamocuj strzykawkę w pompie za pomocą uchwytu.

Następnie delikatnie podłącz przewód łączący między strzykawką a uchwytem igły. Upewnij się, że igła wstrzykująca znajduje się w bezpośrednim kontakcie z przewodem łączącym wewnątrz uchwytu igły. Teraz powoli przesuń roztwór przez przewód łączący, aż na końcówce igły pojawi się mała kropla roztworu.

Starannie przymocuj tłok obok bloku popychacza za pomocą uchwytu na pompie. Ustaw szybkość iniekcji na 8 µL/min oraz objętość iniekcji w zakresie od 1 do 2 µL. Następnie dostosuj ustawienie średnicy strzykawki w pompie tak, aby odpowiadało średnicy używanej strzykawki.

Na koniec, aby chronić szczenięta podczas fazy rekonwalescencji, ustaw temperaturę płyty grzewczej na 38 °C i przykryj ją ręcznikiem papierowym. Zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez IACUC, przygotuj szczenięta myszy w wieku P0 lub P1 do iniekcji, poddając je anestezji chłodniczej. Zwilż kilka ręczników papierowych wodą i umieść je na lodzie.

Następnie umieść cztery lub pięć szczeniąt na ręczniku papierowym w dużych odstępach od siebie. Złóż ręczniki papierowe nad szczeniętami, ostrożnie połóż na wierzchu niewielką ilość kruszonego lodu i inkubuj szczenięta przez około pięć minut. Szczenięta mogą być bezpiecznie utrzymywane w lodzie do 15 minut, co wciąż pozwala na ich pełny powrót do równowagi.

Następnie umieść znieczulonego szczeniaka na bloku montażowym, aby zapewnić optymalny dostęp do miejsca wstrzyknięcia. Do kory mózgowej, na przykład, najłatwiej dotrzeć, kładąc zwierzę płasko na brzuchu. Szczeniaka można przymocować za pomocą plastra; należy ręcznie ustabilizować głowę szczeniaka i mocno naciągnąć skórę, aby zapobiec jego przemieszczaniu się.

Następnie, orientując się według punktów anatomicznych czaszki, takich jak szew lambdoidalny, wybierz drugą ręką powtarzalny punkt wstrzyknięcia i delikatnie wprowadź igłę przez czaszkę. Nie naciskaj mocno, jeśli igła nie przenika łatwo przez kość. Zamiast tego zmień położenie igły i spróbuj ponownie, robiąc to delikatnie.

Głębokość wstrzyknięcia w obrębie kory różni się nieznacznie pomiędzy poszczególnymi zwierzętami i szczepami; zazwyczaj odpowiednia jest głębokość od 0,5 do 1 mm. Teraz należy wstrzyknąć roztwór wirusa, prosząc współpracownika o uruchomienie pompy, aby zminimalizować ruchy dłoni. W idealnym przypadku do uruchomienia pompy po wstrzyknięciu można by użyć pedału nożnego.

Pozostaw igłę w miejscu przez kilka sekund, a następnie, utrzymując głowę szczeniaka w bezruchu, płynnie wysuń igłę. Teraz pozwól szczeniakowi odpocząć od 5 do 10 minut na przykrytej płycie grzewczej.

W tym czasie należy kontynuować wstrzykiwanie pozostałych szczeniąt. Gdy wszystkie szczenięta odzyskają różowy kolor i zaczną się poruszać, należy je delikatnie potrzeć częścią ściółki z ich klatki. Dopiero wtedy mogą one zostać zwrócone matce.

W przeciwnym razie mogłyby zostać potraktowane jako obce szczenięta, które matka najprawdopodobniej zabiłaby po ich powrocie do gniazda. Oczyść zestaw do iniekcji, całkowicie napełniając strzykawkę acetonem lub 70% etanolem. Jeśli używane są komponenty wrażliwe na aceton, takie jak uszczelnienia, precyzyjne elementy lub kleje, przepłucz zestaw do iniekcji roztworem kilkukrotnie, za każdym razem używając świeżej porcji roztworu.

Usunie to wszelkie pozostałości roztworu wirusa oraz osady, a rozpuszczalniki wyparują. Po przepłukaniu układu, zdezynfekuj obszar roboczy wybielaczem, aby pozostawić go w stanie gotowości dla następnego badacza. Prawidłowo wykonana technika zapewnia silną infekcję neuronalną w miejscu wstrzyknięcia.

Wstrzyknięcia do konkretnych obszarów, takich jak kora mózgowia i wzgórze górne, zazwyczaj wywołują miejscowe zakażenia z minimalnym rozprzestrzenieniem na obszary sąsiednie. Zastosowanie roztworu wirusa o wysokim mianie zwiększa prawdopodobieństwo zakażenia obszarów przyległych, takich jak hipokamp, w porównaniu z wstrzyknięciem roztworu wirusa o niskim mianie. To ostatnie skutkuje rzadkim zakażeniem, zazwyczaj w pobliżu miejsca wstrzyknięcia, jak w przypadku wstrzyknięcia do linii środkowej móżdżku; liczba zainfekowanych komórek powinna korelować z mianem wstrzykniętego roztworu wirusa.

Na przykład wstrzyknięcie do móżdżku mieszaniny wysokomianowych roztworów dwóch wirusów AAV8 wykazujących ekspresję różnych białek fluorescencyjnych prowadzi do zainfekowania wielu komórek Purkinjego, które zostają różnicowo oznakowane. Z kolei wstrzyknięcie roztworu wirusa o niskim mianie może skutkować rzadką infekcją, co ułatwia wizualizację pojedynczych komórek. Neurony oznakowane fluorescencyjnie można obserwować bezpośrednio w świeżo pociętej żywej tkance lub poddać je barwieniu immunologicznemu.

Wzmacnia to endogenne sygnały fluorescencyjne w celu późniejszego pozyskiwania obrazów za pomocą szerokopolowej lub konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Na koniec, RAAV eight jest zdolny do infekowania różnych typów neuronów w korze z silnym znakowaniem drobnych wypustek. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje około 30 minut, pod warunkiem, że zostanie przeprowadzona prawidłowo.