Metoda aglutynacji cząsteczek w identyfikacji poliwirusa

Ogólnym celem poniższej procedury jest szybka identyfikacja izolatów wirusa polio przy użyciu prostego protokołu. W tym badaniu wykorzystujemy uczulone cząsteczki żelatyny pokryte cząsteczkami chimerycznymi zawierającymi domenę zewnątrzkomórkową ludzkiego receptora poliwirusa połączoną z fragmentem Fc przeciwciała IgG2. Ponieważ cząsteczki te wykazują jednakową powinowactwo do wszystkich serotypów izolatów poliwirusa, aglutynacja cząsteczek zachodzi podczas inkubacji z próbkami zawierającymi dowolny ludzki poliwirus.

Jednakże, jeśli obecne są przeciwciała zdolne do rozpoznania konkretnego wirusa izolowanego z próbki, dochodzi do neutralizacji, która zapobiega aglutynacji; wykorzystując ten system eksperymentalny, można przeprowadzić szybką identyfikację izolatów poliwirusa w reakcji jednokrokowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak konwencjonalny test neutralizacji, jest prostota procedury i interpretacji, co ma na celu zmniejszenie nakładu pracy oraz skrócenie czasu oczekiwania na wyniki. Aby zrekonstytuować przeciwciała anty-PV1, PV2 oraz PV3, należy dodać 0,5 ml wody do każdej fiolki.

Następnie należy przenieść każdy roztwór przeciwciał do osobnych probówek zawierających 4,5 ml pożywki podtrzymującej. Niektóre partie przeciwciał anty-PV są dostarczane w formie zrekonstytuowanej; w przypadku takich partii przeciwciał anty-PV dodawanie wody w celu rekonstytucji nie jest konieczne.

Następnie w nowych, oznakowanych probówkach przygotować mieszaniny połączonych roztworów przeciwciał w stosunku jeden do jednego, o końcowej objętości 3,6 milliliters. Na przykład zmieszać 1,8 milliliters przeciwciała anti PV one z 1,8 milliliters przeciwciała anti PV two. Aby przygotować kombinację anti PV one plus PV two, powtórzyć tę czynność dla każdej możliwej kombinacji parowej, a także przygotować roztwór zawierający wszystkie trzy rodzaje przeciwciał, mieszając ze sobą po 1,2 milliliters każdego antyserum.

Po przygotowaniu czterech mieszanin, do każdego roztworu przeciwciał należy dodać 720 µL FCS. Pomoże to ograniczyć nieswoistą aglutynację cząsteczek żelatyny przez przeciwciała podczas analizy. Pule przeciwciał można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu ich użycia w teście aglutynacyjnym.

W tym teście wykorzystujemy liofilizowane cząsteczki żelatyny powlekane domenami zewnątrzkomórkowymi ludzkiego receptora poliwirusa oraz domenami FC mysiego IgG2. Aby zapewnić spójność obrazu aglutynacji, należy używać cząsteczek z jednej serii, a nie z różnych partii w ramach jednego eksperymentu. Cząsteczki należy zrekonstytuować, dodając do każdej fiolki 1,5 ml buforu do rekonstytucji. Delikatnie postukać, aby dokładnie wymieszać.

Zrekonstytuowane cząsteczki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie dwa tygodnie. W pierwszej kolejności zaprojektuj eksperyment na 96-dołkowej płycie mikrotitracyjnej. W przypadku każdej próbki studzinka numer jeden będzie zawierać sam wirus.

Do dołków od numeru dwa do pięciu należy wprowadzić wirusa wraz z jednym z czterech mieszanych roztworów przeciwciał. Należy pamiętać o zachowaniu jednego dołka jako kontroli negatywnej, zawierającej wyłącznie medium, bez wirusa i przeciwciał. Po przygotowaniu płytki należy dodać 12 µL odpowiedniego roztworu przeciwciał do każdego dołka w rzędach od drugiego do piątego oraz 12 µL pożywki.

Pożywkę do samych wirusów, do studni w pierwszym rzędzie, oraz do studni kontroli negatywnej w szóstym rzędzie. Następnie dodaj 12 µL próbki wirusa do pierwszych pięciu rzędów oraz 12 µL pożywki do studni kontroli negatywnej w szóstym rzędzie. Po naniesieniu przeciwciał i wirusa, resuspenduj cząstki zrekonstytuowanej żelatyny, delikatnie opukując je, a następnie bezzwłocznie dodaj 25 µL cząstek do każdej z pozostałych studni.

Aby uzyskać taką samą ilość cząsteczek w każdej studzience, należy nie dopuścić do ich osiadania przed przeniesieniem na płytkę. Umieść płytkę testową na mieszalniku do płytek i mieszaj przez 30 sekund. Następnie połóż płytkę na arkuszu białego papieru i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, aby umożliwić zajście aglutynacji.

Ważne jest, aby nie przesuwać płytki w żadnym momencie podczas lub po inkubacji, ponieważ powstała aglutynacja jest niestabilna. Po zajściu reakcji należy wykonać kilka zdjęć płytki, na których będzie można ocenić jakość aglutynacji w każdej studni. W studniach, w których nie nastąpiła aglutynacja, jak pokazano tutaj po lewej stronie, kolorowe cząsteczki żelatyny opadną na dno studni, natomiast w studniach, w których wystąpiła aglutynacja.

W wyniku oddziaływania między wirusem a pvr, cząsteczkami żelatyny pokrytymi IgG 2A, widoczny jest rozproszony, zabarwiony wzór, jak pokazano w centrum. W tym doświadczeniu badaliśmy zdolność roztworów wirusa, PV 1, 2 i 3, do indukowania aglutynacji w obecności przeciwciał. W kombinacjach wskazanych tutaj, w przypadku braku wirusa lub przeciwciał, nie dochodzi do aglutynacji i cząsteczki żelatyny osadzają się, co kontrastuje z dołkiem zawierającym wirusa, ale nie zawierającym przeciwciał.

Doszło do aglutynacji w wyniku oddziaływania wirusa. W studzienkach doświadczalnych zawierających cząsteczki żelatyny pokryte PVR IgG dwa A, aglutynacja wirusów jest zapobiegana w każdej studzience zawierającej przeciwciała specyficznie neutralizujące dany wirus. Na przykład, aglutynacja poliovirusu typu jeden jest zapobiegana w studzienkach zawierających przeciwciała anty PV jeden, ale nie w studzienkach zawierających jedynie przeciwciała anty PV dwa i anty PV trzy.

To samo dotyczy polowirusów typów dwa i trzy. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, może ona zająć zaledwie trzy godziny.