Uśrednianie kolców glikoproteiny otoczki wirusowej z rekonstrukcji kriotomografii elektronowej przy użyciu Jsubtomo

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie struktur kompleksów glikoproteinowych obecnych na powierzchni wirusów otoczkowych. Osiąga się to poprzez uprzednie zlokalizowanie cząstek wirusa w objętościach tomograficznych, które zostały wcześniej obliczone na podstawie danych z kriomikroskopii elektronowej. Drugim krokiem jest stworzenie dwóch statystycznie niezależnych modeli początkowych kompleksów glikoproteinowych przy użyciu ręcznie zdefiniowanego podzbioru danych.

Następnie modele te są udoskonalane, a następnie wykorzystywane do automatycznego wykrywania wszystkich kompleksów glikoproteinowych na cząsteczkach wirusa. Ostatnim krokiem jest udoskonalenie struktury kompleksu glikoproteinowego przy użyciu pełnego zestawu danych. Ostatecznie do interpretacji końcowej struktury wykorzystuje się narzędzia do wizualizacji molekularnej.

Trójwymiarowa analiza strukturalna tych kolców glikoproteiny jest nieoceniona dla zrozumienia patogenezy wirusa, a także dla projektowania leków. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak krystalografia rentgenowska, jest to, że technika ta pozwala na rozwiązywanie struktur białek błonowych w naturalnym środowisku błonowym. Technika ta może pomóc w rozwiązaniu kluczowych tematów z zakresu biologii strukturalnej.

Na przykład struktura wielu błon zawierających wirusy. Chociaż technika ta może zapewnić wgląd w kompleksy glikoproteinowe w tych wirusach, może być również stosowana do innych systemów, takich jak białka błonowe wbudowane w liposomy. Procedura zostanie zademonstrowana przez dwóch członków mojej grupy, Slee i Davida Bittelów.

Aby rozpocząć, otwórz plik autogramu w programie B. Ręczne wybieranie cząstek wirusa w gramach poprzez definiowanie współrzędnej środkowej cząsteczki wirusa za pomocą narzędzia do wybierania cząstek. Powtarzaj ten krok, aż wszystkie warianty zostaną przetworzone.

Zapisz współrzędne wirusa w pliku gwiazdy. Powtórz ten proces dla wszystkich tomów. Następnie uruchom J sub tomo py w trybie wyodrębniania Aby wyodrębnić różne woluminy podrzędne do poszczególnych plików woluminów, użyj zapisanych plików gwiazdki jako plików wejściowych do wygenerowania dwóch niezależnych modeli początkowych.

Najpierw otwórz plik z mapą podobjętości jajnika. Na wystawie B. Wybierz podzbiór spajków w podobjętościach Variana, definiując współrzędną środkową spajka za pomocą narzędzia do pobierania cząstek dostępnego w oknie przybornika.

Powtarzaj ten krok, aż wszystkie wyraźnie wyraźne kolce zostaną przetworzone. Zapisz współrzędne spajków w pliku gwiazdy. Powtarzaj ten krok, aż około 200 kolców glikoproteiny zostanie przetworzonych.

Po przypisaniu widoków do varianów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, utwórz maskę rzeczywistej przestrzeni za pomocą J sub tomo. Utwórz maskę py. Następnie wygeneruj maskę z odwróconą przestrzenią za pomocą J sub tomo utwórz maskę klinową py.

Maska przestrzeni odwrotnej służy do wykluczania regionów w brakującym obszarze klina, wynikającym z zbierania danych tomograficznych w jednej osi. Następnie utwórz dwie początkowe średnie za pomocą J.Sub tomo create średnich. PY przy użyciu zapisanego pliku wyboru jako pliku wejściowego.

Użycie do redukcji szumu w początkowych średnich polega na iteracyjnym wyrównaniu i uśrednieniu dwóch wcześniej wygenerowanych modeli za pomocą J sub tomo iteracji złota PY. Szczegóły dotyczące obu etapów tego procesu można znaleźć w protokole tekstowym. Oceń stopień symetrii w strukturze, badając wynikowy plik mapy z filtrem dolnoprzepustowym w kyira. Na przykład, jeśli kolec jest kompleksem trimerycznym, powinna być widoczna potrójna symetria.

Kontynuuj udoskonalanie struktury zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie wygeneruj nasiona znajdujące się równomiernie na powierzchni Variana w celu dopasowania szablonu i przypisz początkowy wektor widoku do nasion, uruchamiając JVs py. Użyj wcześniej wygenerowanych plików gwiazdek, ponieważ pliki wejściowe generują około 1,5 raza więcej nasion niż oczekiwana liczba skoków.

Ten wektor widoku przybliża kierunek spajka znajdującego się najbliżej każdego punktu początkowego. Następnie wygeneruj dwie niezależne średnie powierzchni wirusa, tak jak poprzednio. Następnie doprecyzuj położenie nasion zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Na koniec wygeneruj pliki znaczników com udoskonalonych plików gwiazd źródłowych za pomocą jvs.py. Zbadaj nasiona, otwierając pliki CMM i powiązane pliki map wirionów. W kyira.

Upewnij się, że rafinowane nasiona są prawidłowo ustawione względem błony wirusa. Udoskonalone znaczniki można pokolorować na podstawie ich korelacji krzyżowej: Współczynniki automatycznie lokalizują wszystkie spajki w podtomach Variana, korzystając z lokalnego dopasowania szablonu wokół uszlachetnionych nasion, wyrównują i uśredniają, zlokalizowane spajki wykorzystują średnie wygenerowane z podzbioru ręcznie wybranych spajków jako początkowe szablony. Dodatkowe szczegóły dotyczące tego procesu można znaleźć w protokole tekstowym, aby zwizualizować wyniki, otworzyć udoskonaloną strukturę skoku w kyira w celu wizualizacji.

Przystąp do dopasowania struktur atomowych. Następnie utwórz złożony model wirionu za pomocą j Subo Create model DO py. Na koniec otwórz model złożony do wizualizacji w kyira.

Początkowy model został dopracowany przy użyciu 205 ręcznie wybieranych kolców. Trzykrotnie. Symetria najbardziej środkowego kolca była oczywista bez stosowania jakiejkolwiek symetrii i została nałożona na kolejne rundy udoskonalania w celu ręcznego wykrycia wszystkich kolców na powierzchniach Variana. Wygenerowano 106 nasion dla każdego vion w promieniu 43 nanometrów i odstępach 20 stopni, a ich pozycje były iteracyjnie dopracowywane względem błony.

Do obliczenia końcowej średniej wykorzystano najlepiej skorelowane plastry kolców glikoproteiny. Średnia została ustalona do rozdzielczości 35 angstremów. Ujawnił trimeryczną strukturę kolców pośrodku, a także pewien wkład sześciu sąsiednich kolców.

Złożone modele wariów obliczone poprzez umieszczenie struktury w znanych pozycjach ujawniły rozmieszczenie kolców na powierzchni variana. Od czasu do czasu widoczne były lokalnie uporządkowane plamy kolców. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby używać tylko najlepszych danych i dokładnie sprawdzić wszystkie wyniki pośrednie.

Po tej procedurze struktury krystalografii rentgenowskiej można dopasować do końcowej średniej, aby uzyskać dokładniejszy obraz interakcji białko-białko. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uśredniać struktury glikoproteiny otoczki wirusa za pomocą J Omo.