Znakowanie ReAsH/FlAsH oraz analiza obrazu białek sensorowych tetracysteiny w komórkach

Ogólnym celem niniejszej procedury jest znakowanie barwnikami flash lub ash komórek wykazujących ekspresję białka z tagiem tetracysteiny i znacznikiem fluorescencyjnym oraz ilościowa analiza uzyskanych wyników. Osiąga się to poprzez najpierw transfekcję linii komórkowej plazmidem niosącym białko fluorescencyjne oraz białko docelowe zawierające tag tetracysteiny. Następnie ekspresowane białko jest znakowane barwnikiem R lub flash, a niespecyficznie związany barwnik jest usuwany poprzez przemywanie BAL w celu przygotowania do obrazowania mikroskopowego.

Następnie wykorzystuje się mikroskop konfokalny do zarejestrowania obrazów fluorescencyjnych komórek w kanałach ash lub flash oraz białka fluorescencyjnego. Na koniec obrazy są analizowane za pomocą programu ImageJ w celu ilościowego określenia wiązania ash lub flash z białkiem docelowym. W efekcie można uzyskać wyniki pokazujące stopień wiązania ash lub flash z białkiem docelowym w komórkach poprzez korelację fluorescencji ash z fluorescencją białka fluorescencyjnego.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak zwykłe znakowanie białka docelowego GFP, jest możliwość śledzenia drugiej właściwości białka, np. zmiany konformacyjnej, oprócz jego lokalizacji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu substruktury i funkcji białek, takie jak zdarzenia oligomeryzacji, zmiany konformacyjne oraz zdarzenia wiązania ligandów, które zmieniają zdolność TAC do wiązania ash lub flash. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy ocenić, w jaki sposób w komórkach tworzą się niewielkie, submikroskopijne polimery met-Huntingtony.

Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy analizy danych są trudne do opanowania ze względu na ich złożoność techniczną. Zaprezentowano procedury eksperymentalne. Kroki od pierwszego do trzeciego zostaną przeprowadzone przez Yasmin Ranson, asystentkę badawczą z naszego laboratorium, która zademonstruje analizę danych. Krok czwarty przeprowadzi Sevki GaN, doktorant z naszego laboratorium. Należy zastosować standardowe metody hodowli komórkowej dla wybranej linii komórkowej oraz przygotować szkiełko do obrazowania żywych komórek do transfekcji.

Przygotuj hodowlę komórek adherentnych i przeprowadź transfekcję plazmidu zawierającego gen zainteresowania z tagiem TC. Zastosuj wybraną metodę transfekcji. Ważne jest zastosowanie kontroli pozytywnych i negatywnych, aby ocenić stopień specyficznego wiązania do tagów TC, a także aby ocenić przenikanie fluorescencji (bleed-through) między kanałami podczas pozyskiwania mikrografii konfokalnych. W przypadku zastosowania dwóch kolorów należy upewnić się, że przygotowano próbki dla pojedynczych kolorów – albo samą białko fluorescencyjne, a jeśli to możliwe, białko Tctech związane z fluorescencją lub odwrotnie.

Jednak bez białka fluorescencyjnego. Od jednego do dwóch dni po transfekcji delikatnie wypłucz komórki 300 µL podgrzanego roztworu soli Hanksa (HBSS), przygotuj świeży, podgrzany roztwór HBSS z 10 µM etanoditiolu (EDT) oraz 1 µM ASH. Po usunięciu HBSS z komórek, delikatnie zastąp go 300 µL medium ASH i inkubuj dokładnie przez 30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych.

Z naszego doświadczenia wynika, że dłuższy czas inkubacji znacząco zwiększa fluorescencję tła. Ostrożnie odessaj roztwór znakujący z komórek i zastąp go 300 µL podgrzanego HBSS z 250 µM 2,3-dimerkapropanolem lub BAL, inkubując przez 15 minut w 37 °C. Usuń roztwór piorący poprzez delikatne odessanie i zastąp go 300 µL podgrzanego HBSS.

Po tym płukaniu komórki można utrwalić za pomocą paraformaldehydu, choć stwierdziliśmy, że zwiększa to nieswoistą fluorescencję tła. Dlatego zazwyczaj obrazujemy żywe komórki w temperaturze pokojowej. Dodatkowo, utrwalenie komórek przed znakowaniem zapobiega wiązaniu barwnika bial.

Aby rozpocząć obrazowanie komórek za pomocą mikroskopu konfokalnego, należy ustawić parametry obrazowania dla poszczególnych fluoroforów i upewnić się, że przenikanie sygnału między kanałami jest pomijalne. Następnie należy dostosować ustawienia fotopowielacza w taki sposób, aby maksymalna fluorescencja w próbce nie nasycała detektora. Po ustaleniu optymalnych ustawień obrazowania nie należy ich zmieniać pomiędzy kolejnymi próbkami.

Zastosuj szybkość skanowania 200 hertz, zbierz cztery średnie z linii i ustaw średnicę otworu pinhole na jedną jednostkę obszaru. Średnicę otworu pinhole można zwiększyć, jeśli problemem jest stosunek sygnału do szumu. Może to jednak spowodować pewną utratę rozdzielczości obrazowania.

Obrazy konfokalne należy zebrać w formacie 12-bitowym lub wyższym, jeśli jest to możliwe, aby zmaksymalizować jakość ilościowej analizy danych. Obrazy należy zebrać dla kanału białka fluorescencyjnego oraz dla kanału barwnika BI arsenal dla wszystkich próbek.

Aby przeanalizować dane, należy użyć oprogramowania Image J z następującymi wtyczkami. W przypadku korzystania z wersji Image J starszej niż 1.32 C należy wybrać następujące opcje. Aby umożliwić jednoczesne otwieranie wielu obrazów, przejdź do edit options input slash output i zaznacz pole use j file chooser to open slash share.

Kliknij OK. Otwórz interesujące obrazy. Program Image J automatycznie zdefiniuje maksymalną i minimalną intensywność pikseli wyświetlaną na ekranie oddzielnie dla każdego obrazu, ponieważ różne obrazy będą miały różną intensywność pikseli.

Oznacza to, że wyświetlane obrazy nie są porównywalne w aktualnym widoku. Aby upewnić się, że wszystkie otwarte obrazy mają tę samą skalę, należy fizycznie zdefiniować górną i dolną intensywność pikseli do wyświetlenia. Aby ustawić te wartości, wybierz obraz, a następnie dostosuj jasność/kontrast.

Kliknij „ustaw”, określ minimalną i maksymalną wartość wyświetlaną. Następnie wybierz opcję rozpropaguj do wszystkich otwartych obrazów i kliknij OK. Alternatywnie można umieścić wszystkie obrazy dla danego kanału razem w jednym pliku lub stosie.

Program Image J automatycznie dostosuje wszystkie obrazy do tej samej skali. Aby to zrobić, wybierz Image Stacks, następnie Images to Stack, wprowadź nazwę wspólną dla każdego pliku i wybierz Use Titles as Labels. Kliknij OK.

Konwertuj wszystkie otwarte obrazy na format ośmiobitowy w celu przeprowadzenia analizy. Wybranie typu obrazu ośmiobitowego spowoduje przeskalowanie wyświetlanego zakresu do przedziału od 0 do 255. Ważne jest, aby nie zapisywać plików w miejsce oryginałów w formacie 12-bitowym lub wyższym, ponieważ spowodowałoby to utratę zawartości informacji.

Zapisz kopię w nowym folderze o nazwie eight bit converted, korzystając z opcji Zapisz jako. Jedną z metod badania stopnia wiązania barwnika biarsal w całym obrazie jest wykonanie wykresu korelacji intensywności pikseli. Wykres ten przedstawia wartość każdego piksela w jednym kanale w odniesieniu do odpowiadającej mu wartości piksela w drugim kanale.

Zatem pozycja piksela o wysokiej fluorescencji GFP będzie również wykazywać wysoką fluorescencję popiołu w przypadku silnego wiązania. Aby przeanalizować korelację pikseli, należy upewnić się, że ośmiobitowe obrazy REA i GFP są otwarte w programie ImageJ. Następnie należy otworzyć wtyczkę Image Correlator, wybierając Plugins > Image Correlator. Następnie przypisz pliki obrazów do Image One i Image Two.

Następnie kliknij OK. Powstały stos może nie wyświetlać żadnych szczegółowych informacji. Jest to zjawisko normalne.

Zapisz stos w nowym folderze o nazwie scatterplots i nadaj mu tę samą nazwę pliku, co próbka, której dotyczy. Na przykład: Ash GFP Correlation plot. Aby wyświetlić dane, wybierz jedną z dwóch opcji.

Najpierw przekształć dane do formatu logarytmicznego, wybierając opcję process math log auto. Następnie, aby wizualnie przeskalować dane, kliknij image adjust brightness slash contrast i wybierz auto. Po drugie, przeskaluj dane wizualnie tak, aby wyświetlały jedynie niskie wartości, a następnie wyświetl dane za pomocą specjalnej tablicy przeglądowej (lookup table) lub LUT, aby stworzyć własną tabelę LUT.

Kliknij opcję edycji kolorów obrazu (LUT), aby uzyskać bardzo prostą tablicę LUT. Kliknij górny lewy piksel i wybierz kolor czarny. Następnie zaznacz następny piksel po prawej stronie i wybierz kolor czerwony.

Następnie kliknij trzeci piksel i, trzymając przycisk myszy, przeciągnij zaznaczenie do dolnego prawego piksela. Wybierz kolor czerwony, kliknij OK, a następnie wybierz kolor biały i kliknij OK. Wybierz zakres jasności i kontrastu od 0 do 255, zgodnie z wcześniejszym opisem, aby zablokować obraz tak, jak jest on wyświetlany na ekranie.

Konwertuj obrazy do formatu RGB, aby móc je kopiować i wklejać do innych programów. Najpierw otwórz obrazy 8-bitowe lub 16-bitowe zgodnie z wcześniejszym opisem. Przypisz schemat kolorów LUT do obrazów dla GFP.

Przypisz zieloną tablicę LUT, klikając na obraz. Tablice wyszukiwania zielone. Na koniec wybierz obraz do skopiowania i skopiuj go do schowka, wybierając opcję edytuj kopiuj do systemu; ta figura przedstawia typowy wynik dla kinazy sock z fuzją GFP i znacznikiem TC, która była barwiona przez 30 minut.

W komórkach HEC 2 9 3 z zastosowaniem ash wydaje się, że ASH wiąże się z wysokim powinowactwem i wydajnością do białka docelowego posiadającego znacznik TC. W przeciwieństwie do tego, na tej rycinie przedstawiono odpowiadającą mu próbkę kontrolną SARK połączonego z GFP, ale pozbawionego znacznika TC, co jest niezbędne do weryfikacji zarówno swoistości znacznika TC, jak i poziomu barwienia tła. Wynik ten pokazuje, że RH nie wykazuje reaktywności z białkiem docelowym pozbawionym znacznika TC, co wskazuje na swoistość znacznika TC w wiązaniu SSH.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie dopuścić do konfluencji i stanu spoczynku komórek, ponieważ wpłynie to na wiązanie V w komórkach. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak w prosty sposób przeprowadzić ilościową analizę danych; metody te można następnie dopracować, aby opracować własne, unikalne IUTS do wizualizacji danych.