Robotyka i dynamiczna analiza obrazu w badaniach ekspresji genów w tkankach roślinnych

W niniejszej procedurze dynamika ekspresji genów w tkankach roślin jest obrazowana w czasie przy użyciu robotyki; najpierw nasiona fasoli zwyczajnej są sterylizowane i umieszczane między zwilżonymi ręcznikami papierowymi w pojemniku do kultur tkankowych w celu ich kiełkowania. Po czterech dniach usuwa się koleoptilia i poddaje ją bombardowaniu konstruktem DNA zawierającym promotor połączony z GFP. Koleoptilia umieszczone w szalkach Petriego są montowane w dwuwymiarowym, specjalnie zaprojektowanym robotycznym systemie gromadzenia obrazów. Robot jest zaprogramowany tak, aby co godzinę przez 100 godzin rejestrować obrazy każdego fragmentu tkanki.

Obrazy poddawane są analizie obrazu, co pozwala uzyskać dane ilościowe dotyczące intensywności ekspresji GFP w czasie. Cześć, jestem John Finer, dyrektor Laboratorium Transformacji Roślin w Departamencie Ogrodnictwa i Nauk o Uprawach na Uniwersytecie Stanowym Ohio. Jestem Carlos Herandez Garcia, doktorant w laboratorium końcowym na Uniwersytecie Stanowym Ohio.

Dzisiaj Carlos zaprezentuje protokół opracowany przez nas do analizy ekspresji genów w tkankach roślinnych z wykorzystaniem zielonego białka fluorescencyjnego. Stosujemy tę opracowaną w naszym laboratorium procedurę do pomiaru aktywności promotora OD. W tym celu klonujemy promotor upstream w stosunku do genu GFP, który pełni rolę naszego genu reporterowego.

Pokażę Państwu, w jaki sposób wprowadzamy kontrolę promotora do rośliny fasola zwyczajna (Lima bean) oraz jak przesyłamy aplikację za pomocą naszego autorskiego zrobotyzowanego systemu rejestracji obrazów. Na koniec omówię nasz protokół analizy obrazu. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przeprowadzić sterylizację powierzchniową nasion fasoli zwyczajnej zgodnie ze standardowymi procedurami.

Umieść wysterylizowane nasiona w siedmiu pojemnikach magenta pomiędzy warstwami wilgotnych ręczników papierowych i inkubuj je przez cztery dni w temperaturze 25 °C. W tym przypadku stosujemy wektor ekspresyjny o wysokiej liczbie kopii, przydatny do analiz promotorów i elementów promotorowych. Wektor ten zawiera gen GFP, który służy do wizualizacji funkcji promotora lub elementu promotorowego w transformowanych tkankach na około jedną do dwóch godzin przed bombardowaniem.

Wyciąć kotyledony fasoli lima z łupin nasiennych. Kotyledony odpowiednie do bombardowania powinny mieć kolor od żółtego do jasnozielonego, być płaskie i wolne od wszelkich uszkodzeń, które mogłyby zakłócić późniejszą analizę obrazu; bezpośrednio po wycięciu umieścić 12 kotyledonów w szalce Petri z pożywką kultur OMS zawierającą sole MS, pięć witamin, 3% sacharozy i 0,2% agaru przy pH 5,7. Następnie przeprowadzić precypitację konstruktu DNA na cząsteczkach wolframu M 10. Przed użyciem resuspendować cząsteczki w sterylnej wodzie do stężenia 100 mg/mL.

Następnie do probówki wirówkowej o pojemności 0,6 ml dodać 25 µL cząsteczek, 5 µL DNA o stężeniu 1 µg/µL, 25 µL 2,5 M chlorku wapnia oraz 10 µL 100 mM sperminy. Inkubować preparat DNA na lodzie przez 5 minut, a następnie odessać i odrzucić 50 µL roztworu znajdującego się nad cząsteczkami. Ponownie zawiesić pokryte DNA cząsteczki pozostałe na dnie probówki, mieszając na wortexie.

Bezpośrednio po wirowaniu w vortexerze pobierz 2 µL Eloqua. Powtórz ten krok wirowania. Po każdym pobraniu Eloqua powlekane cząsteczki należy przechowywać w lodzie i zużyć w ciągu 15 minut.

Po naniesieniu DNA na cząsteczki, nanieś 2 µL cząsteczek na górną część filtra strzykawkowego umieszczonego na środku sita filtrującego. Następnie umieść filtr strzykawkowy w uchwycie do filtrów wewnątrz komory wlotowej cząsteczek (tzw. PIG - particle inflow gun). Umieść ziarno fasoli lima w pozycji poziomej, stroną osiową do góry, na przegrodzie składającej się z sita stopionego z dnem zlewki.

Umieść przegrodę, która służy jako platforma do podtrzymywania tkanek podczas bombardowania w komorze działa cząsteczkowego. Aby przeprowadzić bombardowanie tkanki, najpierw otwórz zawór prowadzący do próżni, aby odessać powietrze z komory. Gdy próżnia osiągnie 760 millimeters of mercury, aktywuj solenoid i wpuść hel, aby napędzić cząsteczki.

Ciśnienie helu wykorzystywane do przyspieszania cząstek wynosi od 50 do 60 PSI. Po bombardowaniu cząstkami zamknij zawór linii próżniowej i zwolnij próżnię za pomocą zaworu upustowego. Po zwolnieniu próżni otwórz drzwi komory, aby wyjąć bombardowany co leadin i zwrócić co leadin na stronę dal.

Użyć pożywki hodowlanej OMS do kwantyfikacji i profilowania ekspresji. Przeprowadzić bombardowanie dla co najmniej trzech powtórzeń dla każdego konstruktu DNA. Do badania włączono również kontrolę pozytywną, która daje dobrze poznany profil ekspresji genów.

Próbki są teraz gotowe do obrazowania. Włącz lampę rtęciową i odczekaj 30 minut, aż lampa się rozgrzeje. Włącz źródła zasilania dla kamery SPOT R-T-C-C-D oraz sterownika silnika, który napędza ruch specjalnie zaprojektowanej platformy robotycznej przeznaczonej do utrzymywania ośmiu płytek.

Ustaw zestaw filtrów do detekcji GFP, wybierając zestaw dwóch filtrów GFP z wzbudzeniem przy 480 nanometrach i emisją przy 510 nanometrach w mikroskopie stereowym MZ L three. Następnie wysterylizuj pogrubione pokrywki z poliwęglanu do szalek Petriego, spryskując je 70% etanolem. Specjalistyczne pokrywki służące do przykrycia podstawy szalki Petriego zapobiegają kondensacji podczas zbierania obrazów.

Umieść płytki zawierające napromieniowane cuan na platformie robotycznej i dokręć boczny wkręt mocujący, aby ustabilizować ich pozycję. Następnie otwórz dedykowaną aplikację programową sterującą zarówno platformą robotyczną, jak i akwizycją obrazu. Za pomocą oprogramowania włącz przełącznik kontrolera białego światła i ustaw platformę w pozycji domyślnej.

Czynność tę wykonuje się przed wejściem na pozycje. Dla każdego prowadnika coddle w zakładce motor należy wybrać pierwszą płytkę. Platforma ustawi środek szalki Petriego pod obiektywem mikroskopu.

Używając przycisków przesuwania, precyzyjnie ustaw pierwszy CU LEADIN do akwizycji obrazów. Korzystając z funkcji trybu na żywo, przesuń cuddle leaden do odpowiedniego obszaru widoczności. W przypadku pierwszego cuddle leaden użyj pokręteł manualnych w mikroskopie dissecting, aby ustawić ostrość oraz ustawić powiększenie na 1.6 x. Po wyznaczeniu obszaru zainteresowania kliknij przycisk add this position.

Oprogramowanie doda współrzędne tego obszaru do pliku harmonogramu pozycji, a platforma powróci do centrum ustawionych pozycji płyt dla wszystkich pozostałych coen na płytach. Używając przycisków odległości przemieszczenia, należy wykorzystać trzy ręczne śruby poziomujące znajdujące się pod każdą płytą na platformie robotycznej, aby dostosować ostrość dla pozostałych coan na tej samej płycie. Po wprowadzeniu wszystkich współrzędnych wszystkich coan należy zapisać współrzędne harmonogramu pozycji.

Wprowadź parametry zbierania obrazów, takie jak rodzaj światła (dla GFP jest to światło niebieskie) oraz ustawienia ekspozycji, a także określ miejsce zapisywania obrazów zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym. Przejdź do karty kontroli czasu akwizycji i ustaw odstępy czasowe między kolejnymi obrazami oraz całkowitą liczbę cykli zbierania obrazów. Obrazy są zazwyczaj zbierane co godzinę przez 100 h.

Generowanie wyraźnie zdefiniowanych profili ekspresji genów. Rozpocznij akwizycję obrazów, otwierając kartę harmonogramu pozycji, a następnie klikając przycisk uruchom harmonogram. Po zakończeniu 100-godzinnej kolekcji obrazów odizoluj system zbierania obrazów od światła zewnętrznego.

Obrazy o wysokiej rozdzielczości, o rozmiarze około pięciu megabajtów każdy, są gotowe do analizy obrazu. Użyj programu ImageReady, aby złożyć 100 kolejnych obrazów z każdego folderu. Zaimportuj wszystkie sekwencyjne obrazy jako klatki i zmień ich rozmiar na 800 na 600 pikseli, aby przyspieszyć przetwarzanie obrazów.

Następnie nanieś znaczniki na nowej, wprowadzonej warstwie, która jest widoczna we wszystkich klatkach, wykorzystując wybrane punkty GFP w obrazie referencyjnym. Ręcznie wyrównaj każdy obraz, a po zakończeniu wyrównywania usuń warstwę służącą jako referencja i zapisz plik jako pojedynczy plik PSD. Wyeksportuj również wszystkie klatki jako pojedynczy plik MOV, stosując najwyższą rozdzielczość.

Pliki są teraz gotowe do rozpoczęcia kwantyfikacji GFP. Użyj programu ImageJ, aby otworzyć plik MOV i przyciąć obszar o wymiarach 400 na 300 pikseli. Następnie rozdziel kolejne obrazy na kanały czerwony, niebieski i zielony, wykorzystując narzędzie RGB split dla kanałów czerwonego i zielonego.

Odejmij fluorescencję tła, korzystając z narzędzia wtyczki subtract measured ROI dla każdego przekroju. Oblicz ekspresję GFP poprzez dostosowanie poziomów progu i użycie wtyczki przeznaczonej do pomiaru średniej wartości skali szarości na piksel oraz całkowitej liczby pikseli wykazujących ekspresję GFP. Skopiuj wartości wynikowe w ImageJ. Na koniec wklej wartości wynikowe dla kanałów zielonego i czerwonego do programu Microsoft Office.

Program Excel do dalszej manipulacji danymi, aby przybliżyć wyniki wyrównania obrazów. Ta pierwsza animacja pokazuje niedokładność repozycjonowania platformy robotycznej podczas 100-godzinnego eksperymentu. Ruch plam jest artefaktem wynikającym z niemożności powrotu platformy robotycznej do dokładnie tej samej pozycji w każdym punkcie czasowym po ręcznym wyrównaniu obrazu; komórki wykazujące ekspresję GFP są wyraźnie widoczne, a unikalne cechy tego systemu śledzenia można łatwo zwizualizować.

Podczas powtórzeń tej animacji należy zwrócić uwagę na zaznaczone komórki wykazujące ekspresję GFP: komórka obwiedziona czerwonym okręgiem wykazuje bardzo szybki spadek ekspresji od 18 do 20 godzin po bombardowaniu, podczas gdy komórka obwiedziona białym okręgiem wykazuje opóźniony początek ekspresji GFP. Poza animacjami, procedura ta umożliwia szybką kwantyfikację ekspresji GFP w czasie w tkance docelowej fasoli zwyczajnej. Te reprezentatywne wyniki przedstawiają porównawczą kwantyfikację intensywności promotora z wykorzystaniem promotora CAMV 35 S oraz czterech różnych promotorów soi.

Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak wprowadzić DNA do katalin kiełków. Nasiona fasoli Lima umieszczono na robocie, zebrano obrazy do analizy obrazu, a następnie przeanalizowano te obrazy. W naszym laboratorium rutynowo stosujemy tę procedurę do walidacji klonalnych promotorów roślinnych.

Wprowadzenie różnych promotorów roślinnych pozwala na wygenerowanie dużej ilości danych. Procedura ta jest jednak skomplikowana i składa się z wielu etapów, na których mogą wystąpić błędy. Podczas jej przeprowadzania ważne jest, aby rozpocząć od świeżych nasion fasoli lub przynajmniej użyć nasion wysokiej jakości, które były przechowywane w odpowiednich warunkach. Istotne jest również szybkie wycięcie pokrywki do bombardowania i zamocowanie jej na robocie oraz zastosowanie grubej pokrywki naczynia Petri, aby zminimalizować problemy z kondensacją.

Na koniec prosimy zauważyć, że używane przez nas GFP to inna wersja o nazwie SGFP, pochodząca z Gen HIN Lab na Uniwersytecie Harvarda. To GFP nie jest zbyt stabilne i może być lepsze do śledzenia gwałtownych zmian w ekspresji genów. To wszystko z naszej strony, dziękujemy za oglądanie.

Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.