Procedura ligacji i punkcji kątnicy

Witam, nazywam się Miguel Toscano i pracuję w laboratorium dr Deny w Departamencie Mikrobiologii i Hematologii na Temple University. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak przygotować model zapalenia i perforacji indukowanego iCal u myszy szczepu C 57 Black 6. Model ten wykorzystujemy w naszym laboratorium do symulacji sepsy u ludzi.

W zasadzie model ten polega na nakłuciu jelita, co umożliwia przedostanie się materiału kałowego do jamy otrzewnej w celu wywołania sepsy polimikrobowej, generując tym samym nasiloną odpowiedź immunologiczną. W tym modelu wiele organów i różnych typów komórek ulega nieodwracalnemu uszkodzeniu, co w konsekwencji może doprowadzić do śmierci zwierzęcia.

Zacznijmy zatem. Znieczulenie myszy. Pierwszym krokiem jest znieczulenie zwierzęcia poprzez iniekcję doszpikową.

Mieszanina ketaminy i ksylazyny w stosunku jeden do jednego. Aby uniknąć ugryzienia przez mysz i nie wyrządzić jej krzywdy, należy chwycić mysz jedną ręką za ogon. Drugą ręką dociskamy ją do podłoża.

Następnie chwytamy mysz za kark i kładziemy zwierzę na grzbiecie, aby odsłonić brzuch. Za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 29 G wstrzykujemy 20 do 30 µl środka znieczulającego do jamy otrzewnej. Przygotowując mysz do zabiegu, chwytamy ją za kark i golimy brzuch, unieruchamiając ogon i/lub kończynę myszy.

Sprawdzamy, czy mysz nie wykazuje wrażliwości na ból, następnie odkażamy brzuch. Najpierw przecieramy go roztworem Betadinu, a następnie przemywamy wacikiem nasączonym alkoholem izopropylowym przez co najmniej jedną minutę. Wykonanie laparotomii: aby przeprowadzić laparotomię, podnosimy pęsetą skórę w środkowej części brzucha i wykonujemy niewielkie nacięcie o długości około jednego centymetra.

Następnie unieś krocze i wykonaj kolejne małe nacięcie, aby odsłonić jamę otrzewną. Używając zakrzywionej pęsety, przytrzymaj błonę otrzewną. Zidentyfikuj i odsłoń ślepe oko, przeciągając je przez błonę otrzewną.

Umieść go nad brzuchem. Teraz następuje moment podwiązania. Jest to istotny czynnik.

Aby określić ciężkość modelu, można modulować stopień inwazyjności procedury. Poprzez zmianę miejsca podwiązania myszy będą rozwijać łagodniejszą sepsę. Jeśli podwiązanie zostanie wykonane bliżej końca kątnicy, rozwinie się sepsa o umiarkowanym nasileniu; jeśli w połowie – sepsa o średnim stopniu ciężkości, a jeśli bliżej zastawki kInputValue – sepsa ciężka. Ciężkość procedury zostanie odzwierciedlona przez odsetek śmiertelności.

Nigdy nie podwiązuj zastawki ileocekalnej. Teraz wykonaj podwiązanie za pomocą szwu jedwabnego z podwójnym węzłem, aby było szczelne. Trzymając ślepe oko, ostrożnie wykonaj nakłucie blisko miejsca podwiązania, a następnie kolejne nakłucie bliżej końca ślepego oka. Błona ślepego oka jest miękka i bardzo łatwo o jej perforację.

Stosując igły o różnej grubości i wykonując jedną lub dwie perforacje, możemy również modulować stopień nasilenia modelu. Przedstawiona tutaj metoda pojedynczego lub podwójnego nakłucia jest alternatywną techniką w stosunku do klasycznego nakłucia przelotowego. Przewagą metody pojedynczego lub podwójnego nakłucia jest możliwość lepszej kontroli ilości wydalanych kałków podczas uciskania ślepego jelita.

Przytrzymaj kątnicę dwoma palcami i delikatnie ją wyciśnij, aby pobrać niewielką ilość kału. Zamykając laparotomię, podnieś wówczas otrzewną i ostrożnie umieść kątnicę z powrotem w jamie otrzewnej.

Należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć przypadkowego nakłucia kątnicy. Zaleca się użycie większych pincet. Teraz należy zamknąć jamę otrzewną. Używając szwu jedwabnego, należy upewnić się, że jest ona bardzo szczelnie zamknięta.

Zaczynamy od jednej strony rany, gdzie zawiązujemy węzeł. Wykonujemy szwy aż do przeciwległej krawędzi, przerowadzając jedwab pod pętlą poprzedniego nakłucia. Do zamknięcia skóry możemy użyć klamer chirurgicznych typu Mitchell lub klamer refleksyjnych, wykorzystując odpowiednie narzędzie do ich zaciśnięcia.

Załóż tyle klamer, ile jest konieczne, aby upewnić się, że rana jest zamknięta. Przeprowadź resuscytację myszy, wstrzykując podskórnie 1 ml podgrzanego roztworu soli fizjologicznej. Dzięki zastosowaniu igły 25G ten zabieg nawadniania wywoła hiperdynamiczną fazę sepsy, kończąc procedurę.

Umieść mysz pod lampą grzewczą na podczerwień lub alternatywnie na macie grzewczej, aż zwierzę wybudzi się z narkozy. Dostarcz pokarm i wodę na dno klatki i nadzoruj zwierzęta co 8 do 12 godzin, sprawdzając, czy nie wykazują objawów choroby. Podaj buprenorfinę podskórnie w celu zapewnienia przeciwbólowego działania pooperacyjnego.

Innym środkiem przeciwbólowym, który można zastosować, jest T.Tramadol. Objawami sepsy są gorączka, letarg, piloerekcja, biegunka, kulenie się i złe samopoczucie. Bardzo chore zwierzęta wykazują znaczny spadek temperatury ciała i prawie się nie ruszają, aby uniknąć cierpienia.

Na tym etapie zwierzęta powinny zostać poddane eutanazji. W ten sposób wykonujemy ligację tętnicy udowej oraz model punktowy. Mamy nadzieję, że prezentacja tej procedury była dla Państwa interesująca i okaże się bardzo pomocna w przygotowaniach do badań na zwierzętach. Gorąco zalecamy wykorzystanie modeli szkoleniowych lub nieużywanych tkanek w celu ustalenia odpowiedniego stopnia dotkliwości eksperymentów poprzez modyfikację długości ligacji, grubości igły oraz liczby nakłuć.

Z tym wszystkim, do widzenia.