Polimery z pamięcią kształtu do aktywnej hodowli komórek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest hodowla komórek na podłożu o topografii zmieniającej się w czasie. Osiąga się to poprzez zaprogramowanie polimeru z pamięcią kształtu w trwałą formę, która zostanie zapamiętana. Następnie polimer z pamięcią kształtu programuje się w kształt tymczasowy, na który w późniejszym etapie wysiewa się komórki.

Ostatnim krokiem procedury jest wywołanie powrotu polimeru z pamięcią kształtu do jego pierwotnej formy poprzez podniesienie temperatury, co w rezultacie pozwala uzyskać obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej wykazujące zmiany w zachowaniu komórek. Witam, nazywam się Pat Mather. Jestem profesorem inżynierii biomedycznej i chemicznej oraz dyrektorem Instytutu Biomateriałów w Syracuse na Uniwersytecie Syracuse.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z komercyjnymi lub niestandardowymi aparatami do rozciągania komórek jest możliwość zastosowania szerokiej gamy złożonych odkształceń w ramach jednego systemu polimerowego. Nazywam się Jay Henderson. Jestem adiunktem w katedrze Inżynierii Biomedycznej i Chemicznej oraz członkiem Syracuse Biomaterials Institute.

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mechanobiologii, takie jak sposób, w jaki komórki reagują na dynamiczne zmiany w ich środowisku fizycznym. Nazywam się Kevin Davis i jestem doktorantem na Uniwersytecie w Syracuse w Katedrze Inżynierii Biomedycznej i Inżynierii Chemicznej. Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w dwuwymiarową (2D) mechanobiologię, może być również stosowana w innych systemach, takich jak trójwymiarowe (3D) rusztowania zmieniające kształt, wykorzystywane w inżynierii tkankowej.

Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować specjalną komorę utwardzania, wykorzystując szkiełko przedmiotowe, teflonowy dystans o grubości 1 mm oraz płytkę aluminiową. Po zabezpieczeniu komory za pomocą małych klipsów biurowych, należy wstrzyknąć NOA 63 do wnętrza komory przez otwór w teflonowym dystansie, używając igły o rozmiarze 18 G. Następnie komorę należy umieścić na płycie grzewczej ustawionej na 125 °C.

Po podgrzaniu komory należy odczekać pięć minut, aby osiągnęła ona jednorodną temperaturę. Następnie należy utwardzić NOA 63 przez 20 minut, umieszczając lampę UV w odległości 6,5 centymetrów od powierzchni szkła. Usuń NOA 63 z komory, gdy jest jeszcze ciepły, używając żyletki.

Następnie przeprowadź dotwardzanie polimeru z pamięcią kształtu pod światłem UV przez trzy godziny i 40 minut bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 125 °C. Aby scharakteryzować pamięć kształtu NOA 63, przygotuj próbkę w kształcie hantla, prasując na gorąco utwardzoną folię za pomocą specjalnie dostosowanego wykrojnika. Na koniec zamocuj próbkę w analizatorze dynamiczno-mechanicznym z uchwytem do rozciągania.

Ustaw instrument w trybie sterowania siłą i zaprogramuj procedurę testową zgodnie z protokołem pisemnym dołączonym do tego filmu. Wynikiem procedury jest izotermicznie utwardzony polimer z pamięcią kształtu lub folia SMP. Umieść CSMP na płycie grzejnej i ustaw temperaturę wyższą niż temperatura przejścia szklistego, aby zmniejszyć moduł i ułatwić wycinanie. W celu przygotowania poszczególnych próbek z izotermicznie utwardzonej folii SMP.

Wytnij z folii s i p za pomocą żyletki próbkę o pożądanej wielkości. Tymczasowy kształt można utrwalić na kilka różnych sposobów. W tym przypadku użyto laboratoryjnej prasy hydraulicznej z płytami, które mogą być podgrzewane i chłodzone, aby wytłoczyć tymczasową topografię.

Najpierw ustaw temperaturę PLA powyżej temperatury tg. Na potrzeby tej demonstracji wytłaczarka została wykonana poprzez utwardzenie żywicy epoksydowej na płycie winylowej, aby uzyskać tymczasowy kształt równoległych rowków. Wytłaczarkę można wykonać z innych materiałów i z inną topografią, jednak musi być ona sztywniejsza niż NOA 63.

W temperaturze tłoczenia umieść próbki s i p stroną roboczą do dołu na tłoczniku. Następnie umieść próbki wraz z tłocznikiem w prasie. Zastosuj obciążenie wstępne o wartości około 100 kPa, aby zapewnić kontakt między grzejnymi płytami PLA a próbkami; utrzymaj ten stan przez około pięć minut, aby próbki osiągnęły jednolitą temperaturę.

Po osiągnięciu jednorodnej temperatury należy przyłożyć do próbek nacisk od 1 do 6 MPa i utrzymać go przez jedną minutę. SMP ulegnie pęknięciu. W przypadku przyłożenia większego naprężenia.

Zastosuj mniejsze naprężenia, aby wprowadzić topografie o mniejszych amplitudach. Po przyłożeniu nacisku obniż temperaturę poniżej TG, korzystając z funkcji chłodzenia wodnego płyt prasy. Gdy temperatura spadnie poniżej tg, zdejmij przyłożoną siłę przed rozpoczęciem eksperymentu z aktywną hodowlą komórkową.

Światło UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego służy do sterylizacji próbek. Rozmieść próbki stroną aktywną do dołu w sterylnych szalkach bez przykrywek i włącz lampę UV na sześć godzin. Następnie przełóż próbki do nowych sterylnych szalek, układając je stroną aktywną do góry.

Włącz lampę UV na dodatkowe sześć godzin. Próbki muszą zostać doprowadzone do stanu względnej równowagi przed wysianiem komórek. Umieść próbki na płytce 96-dołkowej i dodaj 150 µL pełnego medium wzrostowego.

Medium na dołek. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 30 °C z 5% CO2 do momentu uzyskania pożądanej częściowej regeneracji. W tej demonstracji próbki są inkubowane przez 30 godzin, aby uzyskać wystarczająco dużą amplitudę do wyrównania komórek.

Po uzyskaniu częściowej regeneracji można przystąpić do wysiewu komórek na próbki. Przenieś próbki do nowej płytki 96-dołkowej. Następnie do każdej z tych próbek dodaj 150 µL zawiesiny komórek, C3 H 10 t i połowę.

Większość fibroblastów embrionalnych stosuje się w zagęszczeniu 20 000 komórek na mililitr. Aby uzyskać wyizolowane komórki, należy pozwolić im przytwierdzić się i rozprzestrzenić na tymczasowej topografii poprzez inkubację w temperaturze 30 °C przez 9,5 godziny. Następnie, przed przejściem do kolejnego etapu, należy ocenić morfologię komórek, pobierając próbki, a następnie wykonując ich barwienie i obrazowanie fluorescencyjne.

Materiał ten wykazuje autofluorescencję w większości zakresu UV i światła widzialnego, dlatego w celu zmniejszenia tła zaleca się stosowanie fluoroforów z dalekiej czerwieni widma, takich jak Alexa Fluor 647. Aby próbki zregenerowały się, należy przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i kontynuować hodowlę przez 19 godzin. Pozwala to materiałowi na regenerację, a komórkom na dostosowanie morfologii do nowej topografii. Po inkubacji należy zastosować odpowiednie barwniki, np. falloidynę do obrazowania aktyny filamentowej.

W ostatnim kroku można przeprowadzić obrazowanie komórek na nowej topografii; przedstawiony tutaj jest jednokierunkowy efekt pamięci kształtu materiału objętościowego po utwardzeniu pojedynczej warstwy NOA 63. Procedurę powtórzono trzykrotnie, gdzie gwiazdka oznacza początek utwardzania eksperymentalnego. NOA 63 jest przezroczystym, szklistym ciałem stałym o doskonałych właściwościach pamięci kształtu.

W tym przypadku materiał został utwardzony i wykazuje jednorodną temperaturę przejścia szklistego (TG) wynoszącą 51.1 °C, wyznaczoną na podstawie początku spadku modułu magazynowania. Widoczny tutaj spadek odkształcenia następuje przy zmierzonej tg. Znaczna część z przyłożonego odkształcenia 4.7% została utrwalona po odciążeniu w temperaturze 20 °C, co odpowiada stopniowi utrwalenia wynoszącemu 89.3%. Utrwalone odkształcenie zostało następnie odzyskane z wydajnością 84.4% w stosunkowo niewielkim zakresie temperatur podczas ogrzewania.

Wydajność pamięci kształtu nie wykazała pogorszenia do trzech cykli, co potwierdza fakt, że wszystkie krzywe przebiegały niemal identyczną ścieżką. Amplituda tymczasowej topografii zmniejsza się w czasie w temperaturze 30 °C w ciągu 30 godzin. W temperaturze 30 °C.

Amplituda została zredukowana o około 50% w czasie zero, co wskazano tutaj. W ciągu kolejnych 9,5 godziny ulega ona dalszej redukcji o 10%. Po zainicjowaniu regeneracji poprzez zwiększenie temperatury do 37 °C, amplituda spada do 0,5% amplitudy początkowej w ciągu 9,5 godziny dla zastosowanego urządzenia do tłoczenia i naprężenia tłoczenia wynoszącego 4,9 MPa.

Odpowiada to zmianie funkcjonalnej z rowków o szerokości 13 µm na powierzchnię niemal płaską. Polimer ten regeneruje się w zakresie temperatur od 30 do 37 °C w warunkach hodowli komórkowej. Jest to spowodowane pobieraniem wody z pożywki hodowlanej; woda plastyfikuje polimer, co obniża tg, umożliwiając regenerację w temperaturach poniżej suchego TG wynoszącego 51 °C.

Przykładem zachowania komórek kontrolowanego za pomocą aktywnych podłoży do hodowli komórkowych jest zmiana organizacji cytoszkieletu na tymczasowych podłożach rowkowanych. Przed wywołaniem regeneracji mikrofilamenty aktynowe ustawiają się wzdłuż kierunku rowków. Po regeneracji wywołanej wzrostem temperatury mikrofilamenty ulegają reorganizacji i są zorientowane w sposób losowy.

Z kolei próbki kontrolne o powierzchni gładkiej lub ze statycznymi rowkami nie reorganizują się po zwiększeniu temperatury. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że geometrię komory utwardzania, temperaturę przejścia polimeru, metodę utrwalania odkształcenia oraz skład samego polimeru można dostosować, aby uzyskać pożądane przejście w ramach własnego eksperymentu z zastosowaniem tej procedury. Do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak zmiany w ekspresji genów w odpowiedzi na stymulację mechaniczną z podłoża po jego opracowaniu, można wykorzystać inne metody, np. real-time PCR.

Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny mechanobiologii komórki do badania cytoszkieletu komórkowego, jego reorganizacji oraz fizyki materii miękkiej w dwóch wymiarach. Dziękujemy za zainteresowanie naszą pracą i za obejrzenie materiału.