Rejestracja lawin neuronalnych w kulturach organotypowych za pomocą macierzy wieloelektrodowej

Celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie samoorganizacji aktywności zdrowego mózgu w lawiny neuronalne, będące znakiem rozpoznawczym dynamiki stanu krytycznego w korze mózgowej. Osiąga się to poprzez połączenie koronalnego skrawka warstwowej kory wraz ze skrawkiem śródmózgowia, który dostarcza kora mózgowa istotnych rozwojowo sygnałów dopaminergicznych. W drugim kroku kokultura kory i śródmózgowia jest hodowana na matrycy wieloelektrodowej, co umożliwia wielopunktową stymulację i rejestrację aktywności neuronalnej w kulturze.

Następnie, w ciągu pierwszych jednego do dwóch tygodni, pozwalamy kokulturze spłaszczyć się, rozprzestrzenić i przytwierdzić do powierzchni MEA w inkubatorze wykonanym na specjalne zamówienie, który poddaje kulturę cyklicznej ekspozycji na normalne powietrze i pożywkę. Uzyskane wyniki płynów wykazują spontaniczną samoorganizację czasowo-przestrzennych serii lokalnych potencjałów polowych w lawiny neuronalne. Opiera się to na rejestracjach MEA oraz analizie lawin w trybie offline, która identyfikuje prawo potęgowe w rozmiarach lawin.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak kultury dysocjowane, jest jej systemowy aspekt neuronaukowy. Możemy współhodować wiele obszarów mózgu, a te wieloobszarowe kultury tworzą organizację mózgu poprawną w dużych skalach, takich jak warstwy kory i systemy projekcyjne. Zastosowania tej techniki wykraczają poza samo badanie lawin neuronowych.

Na przykład możemy badać odpowiedź na bodziec na poziomie sieci w precyzyjnie kontrolowanych warunkach in vitro. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ prawidłowe zastosowanie mieszaniny osocza i trombiny oraz rozmieszczenie tkanki na MEA są trudne do opanowania. Kroki te wymagają odpowiedniego wyczucia czasu, właściwego gradientu temperatury oraz unikania bezpośredniego dotykania delikatnej powierzchni MEA.

Aby przygotować sterylną, szczelną szklaną komorę do rejestracji, należy najpierw odciąć gwintowane cylindry szklane z teflonową zakrętką, około dwóch milimetrów od dołu gwintu. Są one niezbędne do bezpiecznego i szczelnego zamknięcia komory hodowlanej. Następnie należy oczyścić szklane pierścienie, płucząc je trzykrotnie wodą, a następnie gotując przez pięć minut w czystym etylu alkoholowym o stężeniu 200 proof.

Odstawić je do wyschnięcia. Do przymocowania szklanych pierścieni do powierzchni MEA wymagany jest roztwór silikonowy. Należy użyć zestawu elastomeru silikonowego Cell Guard 180 4 i dokładnie wymieszać 15 ml komponentów A i B. Następnie pozostawić mieszaninę na 15 minut w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.

Rozdziel roztwór na próbki o objętości 1 mL w probówkach Eloqua i przechowuj w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia. Następnie przyklej szklany pierścień do MEA, pobierając 1 mL silikonu o temperaturze 23 °C do strzykawki z igłą o małym rozmiarze i nakładając go na niepolerowaną powierzchnię cięcia szklanego pierścienia. Potem wycentruj szklany pierścień na MEA i nałóż dodatkową warstwę silikonu wokół zewnętrznej krawędzi pierścienia, aby zapewnić szczelniejsze uszczelnienie.

Pozostawić do utwardzenia przez jedną do dwóch godzin w temperaturze około 60 °C na płycie grzejnej. Następnie wysterylizować komorę MEA oraz nakrętki komory w komorze z laminarnym przepływem powietrza, płucząc je trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie trzykrotnie 70% alkoholem, pozostawiając go przy ostatnim płukaniu. Pozostawić komorę w alkoholu na 10 minut.

Następnie poddaj wnętrze komory oraz zakrętki działaniu światła UV przez 10 minut. Sterylizuj w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 45 minut. Po sterylizacji pozostaw je do wyschnięcia.

Następnie pokryj powierzchnię MEA wewnątrz komory hodowlanej poli-D-lizyną. Nowe MEA użyte w tym eksperymencie są dość lipofilne, dlatego należy je pokrywać metodą wielokrotnego nakładania kropli. Po każdym nakładaniu odessaj roztwór z siatki elektrod.

Załóż zakrętkę, aby uszczelnić komorę MEA na czas przechowywania i przyszłego użycia. Procedura ta pozwala na uzyskanie przekrojów kory oraz VTA dla około 12 kokultur i powinna być przeprowadzana wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych, z wykorzystaniem zdrowych zwierząt w pierwszym lub drugim dniu po urodzeniu; całkowity czas pobierania tkanek nie powinien przekraczać jednej godziny. Po dekapitacji rozpocznij usuwanie mózgu, wykonując najpierw dwa boczne cięcia nożyczkami w celu usunięcia skóry ze skalpu.

Usunąć tkanki, a następnie rozciąć czaszkę za pomocą precyzyjnych nożyczek okularowych, wykonując jedno cięcie wzdłuż linii pośrodkowej sagi oraz jedno cięcie wieńcowe na połączeniu kory z móżdżkiem. Odchylić wszystkie cztery płaty czaszki, aby odsłonić mózg. Następnie za pomocą zaostrzonej szpatułki przeciąć czołowo opuszki węchowe.

Następnie przesuwaj szpachelkę w odstępach co jedną czwartą obwodu pod mózg. Delikatnie unieś mózg z czaszki i pozwól mu zsunąć się do schłodzonego roztworu gazowego w celu szybkiego schłodzenia i tymczasowego przechowywania.

Powtórz powyższą procedurę dla dwóch kolejnych mózgów. Aby uzyskać tkankę VTA, przenieś mózgi na sterylną, suchą szalkę Petriego. Za pomocą małej szpatułki usuń nadmiar płynu, delikatnie przesuwając każdy mózg w bok o około jeden centymetr.

Następnie za pomocą żyletki usuń pień mózgu, wykonując pionowe cięcie w płaszczyźnie czołowej na poziomie móżdżku. Teraz przyklej blok agaru do dysku montażowego w celu stabilizacji mechanicznej mózgów podczas procedury krojenia. Następnie za pomocą małej szpatułki nanieś cienką linię superglue na dysk, kilka milimetrów przed blokiem agaru, unikając kontaktu kleju z agarem.

Przenieść i zamocuj każdy mózg stroną bieguna czołowego do dołu. Upewnij się, że bieguny czołowe są przyklejone do dysku montażowego, a strony brzuszne dotykają agaru bez żadnych pozostałości kleju. Zapewnia to odpowiednią stabilizację mechaniczną podczas krojenia i łatwe zdejmowanie wyciętych plastrów.

Następnie ostrożnie zanurz i zamocuj dysk montażowy z zamocowanymi mózgami w tacy wibracyjnej wypełnionej schłodzonym roztworem gaze. Następnie, używając starannie oczyszczonego ostrza żyletki, wykonaj coronalne przekroje śródmózgowia o grubości 400 µm przy najwyższej częstotliwości wibracji i stosunkowo niskiej prędkości przesuwu; za pomocą odwróconej pipety Pasteura z gruszką ssącą zbierz i przenieś plastry zawierające VTA do szalek Petriego o wymiarach 35 × 10 mm wypełnionych sterylnym schłodzonym roztworem gaze do przekrojów korowych. Powtórz poprzednie kroki krojenia, ale wykonaj cięcie pionowe pomiędzy korą a móżdżkiem i zamocuj cztery mózgi biegunem czołowym skierowanym do góry.

Pobrać około trzech przekrojów czołowych o grubości 350 mikrometrów, zaczynając od poziomu prążkowia. Następnie, używając mikronoża wykonanego z odłamków żyletek, wyciąć pod mikroskopem stereoskopowym przekroje czołowe kory przedczołowej oraz obszarów śródmózgowia zawierających VTA o szerokości około dwóch milimetrów. Pobrać sekcje tkanki osobno do małych naczyń wypełnionych schłodzonym roztworem gaze.

Aby rozpocząć montaż tkanki w pierwszej pozycji komory MEA, należy ustawić MEA w temperaturze pokojowej pod mikroskopem stereoskopowym, ustawiając ostrość na matrycę elektrod. Następnie należy nanieść kroplę 25 µL osocza na czystą, wolną od kurzu i sterylną matrycę elektrod. Za pomocą małej szpatułki należy ostrożnie wsunąć przekrój kory i VTA do kropli osocza.

Następnie umieść MEA na płytce chłodzącej i ponownie ustaw ostrość obrazu. Pozostaw próbkę do schłodzenia na około 15 sekund, a następnie dodaj 25 µL trombiny do kropli plazmy. Używając końcówki pipety z trombiną, ostrożnie rozprowadź mieszaninę plazmy z trombiną po powierzchni MEA, wykonując małe, koliste ruchy.

Należy uważać, aby nie dotykać bezpośrednio kruchej matrycy elektrod. Następnie delikatnie umieść korę na matrycy tak, aby jej grzbietowa krawędź biegła wzdłuż drugiego rzędu elektrod. W ten sposób rozwijające się warstwy powierzchowne z czasem pokryją pozostałą część matrycy.

Następnie umieść VTA obok brzusznej krawędzi przekroju kory. Teraz nałóż pokrywkę i luźno zamknij komorę MEA, aby utrzymać wysoką wilgotność. Pozostaw zestaw kultury MEA na około sześć minut wewnątrz dygestorium w temperaturze pokojowej, aby umożliwić działanie trombiny osoczowej i koagulację.

W międzyczasie powtórz procedurę, aby przygotować trzy kolejne kultury. Następnie, w formie małych kropli, ostrożnie dodaj 600 µL pożywki do komór hodowlanych, używając strzykawki 1 cc z igłą o rozmiarze 25 G i długości 5/8 cala. Następnie szczelnie zamknij komorę MEA i umieść zestaw hodowlany MEA na kołyszącej tacy do przechowywania wewnątrz inkubatora.

Po dwóch dniach in vitro należy dodać 10 µL inhibitora mitozy. Następnie, w czwartym dniu in vitro oraz co cztery dni w dalszej kolejności, należy odświeżyć pożywkę hodowlaną w 60%. Podczas normalnego wzrostu hodowla ulegnie znacznemu spłaszczeniu i lekko rozszerzy się w kierunku grzbietowym.

Ze względu na rozwój powierzchownych warstw kory, zdrowa hodowla jest rozpoznawana po nieprzezroczystej szarej tkance w oświetleniu w jasnym polu. Z kolei jasne, odblaskowe pęcherzyki, charakterystyczne dla obumarłych komórek degenerujących się około 10 do 12 dni po przygotowaniu hodowli, sygnalizują gotowość do rejestracji i stymulacji. Aby rozpocząć sesję rejestracji, MEA zostaje przeniesiona z tacy do przechowywania do głowicy rejestrującej.

Aby zarejestrować lokalny potencjał polowy (LFP), należy zastosować filtr pasmowoprzepustowy w zakresie od 1 do 200 hertz. Aktywność wielojednostkową można również badać, używając filtra pasmowoprzepustowego od 300 do 3000 hertz. Zdrowa aktywność spontaniczna ma tendencję do występowania w seriach o zróżnicowanej wielkości i czasie trwania.

Aby zbadać zależność między LFP a aktywnością jednostek, możemy obliczyć średnie LFP wyzwalane impulsami (spike triggered averages). W przypadku tych kultur kory ujemne odchylenia LFP korelują z impulsowaniem neuronalnym podczas rejestracji aktywności wywołanej bodźcem. Najpierw, za pomocą oprogramowania sterującego generatorem bodźców, określa się przebieg czasowy i amplitudę bodźców.

Przydatnym paradygmatem stymulacji jest pojedynczy wstrząs o kontrolowanym ładunku i neutralnym ładunku z bipolarnym przebiegiem prostokątnym. Następnie wybiera się elektrodę, która zostanie wykorzystana do dostarczenia bodźców. Typowe odpowiedzi LFP wywołane bodźcami przypominają serie aktywności spontanicznej.

Układy blokujące odłączają wzmacniacze podczas stymulacji, aby zredukować artefakty stymulacyjne i zapobiec nasyceniu wzmacniaczy. Elektroda stymulująca wymaga kilku sekund na regenerację po stymulacji, przez co nie może być wykorzystana do rejestracji aktywności odpowiedzi. Na MEA tendencje te przejawiają się w postaci klastrów spacjoczasowych z aktywnością w jednej elektrodzie, często towarzyszącą aktywności w innych miejscach.

Jednocześnie przedstawiono tutaj typowe przebiegi LFP podczas takich okresów aktywności poprzez nałożenie na siebie trzech klastrów występujących w odstępach kilku sekund dla każdego klastra. Ujemne odchylenia LFP są widoczne na kilku elektrodach w oknie jednej sekundy; podczas wyodrębniania szczytów NLFP przekraczających próg wielokrotności ujemnego odchylenia standardowego (sd), aktywność w formie czasów wystąpienia szczytów NLFP jest wygodnie wizualizowana na wykresie typu raster, w którym kolumny kropek reprezentują niemal jednoczesne NPS na różnych elektrodach. Organizacja czasoprzestrzenna tej aktywności jest dość złożona.

Kolumny, które w niskiej rozdzielczości czasowej wydają się w większym lub mniejszym stopniu jednorodne, składają się z oddzielnych klastrów w wyższej rozdzielczości czasowej i tak dalej. Powstawanie klastrów przestrzennych, GEOTEMPORAL oraz LFP jest wysoce zorganizowane w sieciach korowych. Bardziej szczegółowo, organizacja ta jest niezależna od skali w przypadku lawin neuronalnych.

Zostało to zademonstrowane poprzez obliczenie prawdopodobieństwa wystąpienia rozmiarów klastrów przy danej rozdzielczości czasowej Delta T. W tym przypadku klastry składają się z NL FPS występujących w tych samych lub kolejnych przedziałach czasowych; gdy rozmiar takiego klastra jest wyrażony jako całkowita liczba NFPS na klaster lub zintegrowane amplitudy NLFP na klaster, rozkłady rozmiarów klastrów wykazują prawo potęgowe z wykładnikiem bliskim -1,5. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak starannie przeprowadzić dysekcję tkanki mózgowej i hodować kultury na matrycach wieloelektrodowych w celu zbadania samoorganizacji aktywności neuronalnej.

Metody te zostały wykorzystane również do badania zależności między aktywnością spontaniczną a aktywnością wywołaną bodźcem w sieciach korowych.