Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia w stadium E 12.5 do analizy rozwijających się neuronów dopaminergicznych. W tym celu w pierwszej kolejności przeprowadza się wycinek mózgu embrionalnego. Następnie mózg jest zatapiany w niskotopliwym aerosie.

Trzecim krokiem jest wykonanie przekrojów plastrów mózgu przy użyciu vibrotomu. Ostatnim etapem jest wybór odpowiedniego plastra mózgu do hodowli i obrazowania time-lapse. Ostatecznie obrazowanie time-lapse oraz mikroskopia immunofluorescencyjna są wykorzystywane do ukazania wczesnych etapów rozwoju neuronów dopaminergicznych, ich zachowania migracyjnego oraz różnicowania.

Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurorozwoju, takie jak śledzenie neuronów i ich zachowań migracyjnych podczas rozwoju brzusznej części mózgu. Na jeden dzień przed sekcją należy przygotować bufor Krebsa 1X oraz pożywkę hodowlaną, zgodnie z instrukcjami zawartymi w towarzyszącym manuskrypcie, około dwóch godzin przed sekcją. Przygotuj 100 mililitrów 4% agarozy niskotopliwej w buforze Krebsa, podgrzewając roztwór w kuchence mikrofalowej do momentu całkowitego rozpuszczenia agarozy.

Następnie umieść aros w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C. Kolejno napełnij tackę buforową Vibram lodowatym buforem Krebsa. Włącz element chłodzący i utrzymuj temperaturę na poziomie czterech stopni Celsjusza.

Następnie zamocuj żyletkę w uchwycie do ostrza. Przygotuj skalpel, cienki pędzelek oraz miniaturową łyżkę z dziurkami do wyławiania plastrów z obszaru wibratora w celu ich późniejszego cięcia. Następnie wlej bufor Krebsa do sterylnych szalek Petriego i przechowuj je w lodzie.

W obszarze sekcji przygotuj trzy duże sterylne szalki Petriego do sekcji i dwie małe sterylne szalki Petriego do zatapiania, parę małych nożyczek, dwie pary precyzyjnych pincet, miniaturową łyżeczkę perforowaną, szklaną pipetę Pasteura polerowaną ogniowo z okrągłą zamkniętą końcówką oraz jeden litr buforu Krebsa w lodzie. Przetrzyj wszystkie narzędzia do sekcji 70% etanolem. Następnie dodaj pożywkę hodowlaną do dołków płytki 6-dołkowej i inkubuj ją w temperaturze 37°C przez dwie godziny.

Następnie, w warunkach sterylnych, należy dodać 1,5 milliliters buforu Krebsa z penicyliną i streptomycyną do każdej studni kolejnej płytki sześciodołkowej. W studniach należy umieścić wkładki z membranami Milli Cell. Płytkę sześciodołkową należy ustawić obok wibratomu, tak aby możliwe było przeniesienie skrawków mózgu na membrany filtracyjne.

Bezpośrednio po wykonaniu przekrojów uśmierć ciężarną samicę myszy z embrionami w stadium E 12.5 i usuń macicę, podnosząc ją pęsetą. Następnie za pomocą drugiej pęsety oddziel mięsień macicy od trzonu macicy. Po tym kroku umieść macicę pod mikroskopem w schłodzonym na lodzie buforze Krebsa.

Używając precyzyjnej pęsety, oddziel ścianę mięśniową macicy, błonę Rikera oraz wisceralny worek żółtkowy od zarodka. Następnie wyjmij zarodki z macicy i przenieś je do oddzielnej szalki Petriego z jałowym buforem Krebsa. Następnie odetnij głowę każdego z zarodków.

Ustabilizuj głowę, przebijając ją na wysokości oczu za pomocą precyzyjnej pęsety. Używając drugiej pęsety, ostrożnie usuń skórę oraz czaszkę. Następnie delikatnie unieś mózg i przenieś go do szalki Petriego z jałowym buforem Krebsa.

Następnie przemyć mózgi w 4% low melting point agarose. Osadzić dwa lub trzy mózgi jednocześnie w 4% świeżym low melting point agarose. Użyć do tego pipety Pasteura z wypłukaną ogniem okrągłą końcówką.

Następnie umieść naczynia do zatapiania na lodzie, starając się rozmieścić je jak najrównomierniej. Potem unieś mózgi, aż dno aros stężeje, tak aby mózgi mogły osiaść równomiernie i równolegle do dna bloku aros. Gdy aros całkowicie stężeje, przytnij aros otaczający mózgi.

Następnie przyklej blok do stolika preparatowego wibrotomu. Podczas przyklejania bloku upewnij się, że strona brzuszna mózgu jest równoległa do platformy. Wykonaj poziome przekroje o grubości 300 micron przy częstotliwości 50 hertz, amplitudzie ostrza 1,1 milimetra i prędkości 25 milimetrów na sekundę.

Zbierz plastry mózgu, używając cienkiego pędzla do przesunięcia plastra na mini dziurkowaną łyżeczkę. Następnie przenieś je pod mikroskopem do naczynia z jałowym, lodowatym buforem Krebsa. Wybierz plaster zawierający tkankę brzusznej części śródmózgowia.

Na tym etapie należy użyć małej łyżki z otworami oraz cienkiego pędzla, aby przenieść skrawki mózgu na wkładki z błony mili cell w płytce 6-dołkowej zawierającej wcześniej przygotowany bufor Krebsa. Następnie należy przenieść membrany ze skrawkami do innej płytki 6-dołkowej z pożywką hodowlaną, dbając o to, aby góra membran pozostała sucha, tak aby skrawki mózgu otrzymywały pożywkę od dołu, a od góry miały dostęp do powietrza.

Umieść plasterki w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 degrees Celsius. Bardzo ważne jest, aby plasterki zostały umieszczone w inkubatorze w ciągu dwóch godzin po początkowym etapie dysekcji. Plasterki te mogą być utrzymywane in vitro przez okres od trzech do czterech dni.

Po czterech do pięciu godzinach regeneracji plastry można wykorzystać do obrazowania poklatkowego bezpośrednio przed rozpoczęciem procedury. Do naczynia należy dodać 1,5 µl kwasu askorbinowego o stężeniu 200 mM, aby chronić plastry przed fototoksycznością.

Inkubuj skrawki w komorze środowiskowej w temperaturze 37°C przy 5% dwutlenku węgla podczas obrazowania time-lapse. Oto świeży skrawk przedstawiający prawidłowe rozmieszczenie neuronów dopaminergicznych w brzusznej części śródmózwia, w którym projekcje do przedmózgowia nie rozwinęły się jeszcze. Po jednym dniu hodowli zaczynają formować się projekcje do przedmózgowia, co wskazano żółtą strzałką.

Białe groty strzałek wskazują położenie ciał komórkowych przedstawionych w większym powiększeniu na wstawkach. Tutaj widoczna jest droga migracji neuronów znakowanych YFP. Na ostrym przekroju poziomym początkowe położenie komórek zaznaczono czerwonym grotem strzałki.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować skrawki genotypowe z zarodkowego śródmózgowia morskiego w stadium E 12.5, aby uzyskać żywotne i nieuszkodzone skrawki. Ważne jest, aby ostrożnie przeprowadzić sekcję zarodkowego mózgu, a po cięciu w wibratomie wybrać odpowiedni skrawka mózgu do hodowli i obrazowania w trybie TimeLapse.