Lentiwirusowa manipulacja genetyczna i wizualizacja neuronów sensorycznych węchu in vivo

Jednym z wyzwań w badaniu rozwoju w neuronauce jest obrazowanie morfologii dendrytów i aksonów na poziomie pojedynczej komórki in vivo. W układzie węchowym neurony sensoryczne węchu wysyłają swoje aksony z nabłonka węchowego w nosie do cebulki węchowej w mózgu. Ponieważ wiele neuronów sensorycznych węchu rzutuje w stronę cebulki węchowej, łączą się one w pęczki.

Utrudnia to badanie trajektorii poszczególnych aksonów oraz morfologii ich zakończeń. Opracowaliśmy metodę wizualizacji pojedynczych neuronów sensorycznych węchowych in vivo poprzez mikrowstrzyknięcie konstruktu GFP przenoszonego przez lentiwirusa.

Skuteczna transdukcja za pomocą lentiwirusa pozwala na doświetlenie całej długości aksonu neuronu sensorycznego węchu, w tym jego drzewka końcowego. Oprócz wizualizacji pojedynczych neuronów sensorycznych węchu, metoda ta umożliwia manipulację ekspresją konkretnego genu zainteresowania w celu zbadania jego funkcji w kontekście in vivo. Procedura z użyciem lentiwirusa odpowiada drugiemu poziomowi bezpieczeństwa biologicznego i musi być przeprowadzana w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Aby zachować sterylność środowiska, spryskaj 70% etanolem wszystkie przedmioty wprowadzane do komory dygestorium. Przed wstrzyknięciem przygotuj i podgrzej kąpiel wodną do 37°C przez co najmniej 20 minut. Szczelnie zamknij plastikowy worek do przechowywania wypełniony w połowie wodą i ustaw go na pustym inkubatorze blokowym.

Pozwoli to myszom na rekonwalescencję po iniekcji. Napełnij pojemnik na odpady biologiczne 10% bleach, aby zdekontaminować wszystkie materiały narażone na kontakt z wirusem. W ramach tej procedury przygotuj małą otwartą szalkę z 70% ethanol oraz drugą szalkę z jałową wodą destylowaną.

W komorze z laminarnym przepływem powietrza będziemy używać strzykawki Hamiltona o pojemności 5 µL z igłą o rozmiarze 33 G. Ten konkretny model pozwala na regulację oporu tłoka poprzez obracanie pokrętła naciągu znajdującego się u góry komory tłoka. Funkcja ta zapewnia kontrolę objętości mikroiniekcji w celu sterylizacji igły i komory strzykawki.

Kilkakrotnie odessaj i wypuść etanol z naczynia. Przepłucz wkład strzykawki, odsysając i wypuszczając wodę sterylną kilka razy. Odłóż strzykawkę w bezpieczne miejsce wewnątrz dygestorium z laminarnym przepływem powietrza.

Przygotuj gaziki nasączone alkoholem w pobliżu stanowiska do iniekcji. Przygotuj platformę do iniekcji, zapewniającą podwyższoną powierzchnię, co ułatwi pozycjonowanie myszy. Można w tym celu wykorzystać odwróconą szalkę Petriego o średnicy 10 cm, przykrytą chusteczkami Kim wipes.

Szczyki myszy można znieczulać poprzez hipotermię aż do wieku odsadzenia. Odetnij palec z gumowej rękawiczki i umieść w nim szczyka myszy. Następnie pozostaw go na lodzie przez pięć minut.

Rękawiczka zapobiegnie oparzeniom skóry, które mogłyby wystąpić w wyniku bezpośredniego kontaktu z lodem. W celu sprawdzenia dokładności znieczulenia należy ucisnąć tylne łapy szczeniaka, aby upewnić się, że zwierzę nie reaguje. Jesteśmy teraz gotowi do mikroiniekcji lentiwirusa. Procedurę zademonstrujemy na nowonarodzonym szczeniaku.

W przypadku użycia myszy w starszym wieku należy zastąpić igłę o rozmiarze 33 G igłą o większej średnicy, aby móc przebić powierzchnię czaszki. Zdezynfekuj powierzchnię nosa myszy, przecierając ją wacikiem nasączonym alkoholem. Wyjmij zapasy lentiwirusów z zamrażarki i rozmroź je na lodzie.

Wytworzyliśmy lentiwirusy w laboratorium we własnym zakresie, stosując uznane metody. Opracowując tę metodę, stwierdziliśmy, że do uzyskania dobrego poziomu transdukcji wymagany jest minimalny miano wirusa rzędu 10⁹ jednostek zakaźnych na ml. Pobierz 2 µL roztworu zapasowego lentiwirusa do wysterylizowanej strzykawki Hamiltona.

Umieść młode myszy na platformie do iniekcji. Chwyć skórę na szczycie głowy w okolicy uszu i delikatnie odciągnij ją do tyłu. Nasz dygestorium wyposażyliśmy w stereomikroskop.

Aby precyzyjnie przeprowadzić mikrowstrzyknięcia, należy odnaleźć na grzbietnej powierzchni czaszki w obrębie przedmózgowia zarys opuszki węchowej. Cele naszych mikrowstrzyknięć znajdują się w bezpośrednim sąsiedztwie opuszki węchowej, jednak nie powinny obejmować samej opuszki. Wykonujemy cztery wstrzyknięcia do nabłonka węchowego u każdego szczenięcia.

Pozycje te, oznaczone niebieskimi kropkami, wymagają wprowadzenia igły pod kątem skierowanym przyśrodkowo. Dodatkowe dwa wstrzyknięcia, oznaczone zielonymi kropkami, są rozmieszczone naprzemiennie, bardziej przyśrodkowo i przednio w stosunku do opuszki węchowej. Wstrzyknięcia te można wykonać pod kątem w obu kierunkach.

Sugerowane kąty wprowadzenia igły wynikają z brzusznego położenia nabłonka węchowego, który znajduje się głównie pod opuszką węchową. Dostęp prostopadły jest zatem ograniczony. Wprowadź igłę przez górną część jamy nosowej około trzech milimetrów poniżej powierzchni skóry.

Aby dotrzeć do nabłonka węchowego. Doświadczony operator powinien wyczuć spadek oporu w momencie dotarcia do przestrzeni światła jamy nosowej. Należy unikać tego obszaru.

Wstrzyknij mikrostrzykawką 0,5 µL roztworu zapasu wirusa w każdą pozycję. Ponownie, wybierając dwa miejsca na każdą stronę, lewą i prawą, wykonaj łącznie cztery wstrzyknięcia po 0,5 µL. Oznacza to, że na jedną mysz przypada 2 µL wirusa potrzebnego podczas jednej sesji wstrzyknięć.

Ponownie, należy uważać, aby podczas wstrzykiwania do opłaty węchowej osuszyć wszelkie pozostałości roztworu wirusa lub krwi, które mogą wyciekać z miejsca wstrzyknięcia lub otworów nozdrzy. Używając chusteczki nasączonej etanolem, wyrzucić ją do pojemnika z rozcieńczonym roztworem wybielacza, a następnie niezwłocznie umieścić wstrzykniętą mysz w inkubatorze wodnym w celu rekonwalescencji. Zdezynfekować igłę i strzykawkę, powtarzając procedurę sterylizacji wykonaną podczas przygotowania. Wstrzyknięte myszy mogą wrócić do klatki 30 minut po rekonwalescencji w inkubatorze wodnym.

Całą procedurę mikroiniekcji można powtórzyć po upływie czterech godzin. Aby zwiększyć liczbę zainfekowanych neuronów sensorycznych węchu, można je wizualizować na całej długości komórki już po trzech dniach. Zwierzęta są uśpione i poddane perfuzji w celu obserwacji w wybranym punkcie czasowym.

Stosując standardowe metody w celu wizualizacji trajektorii i zakończeń aksonów pojedynczych, transdukowanych neuronów receptorowych węchu, przeprowadzamy koronalną sekcję opuszki węchowej z grubością przekroju 60 µm. Przekrój ten będzie zatem zawierał wszystkie warstwy komórkowe opuszki węchowej, w tym pęczki aksonów neuronów receptorowych węchu oraz zakończenia aksonalne tworzące synapsy w strukturach kłębkowych zlokalizowanych na powierzchni opuszki, w ramach przygotowania do immunohistochemii metodą pływającą. Wykonuje się seryjne przekroje opuszki węchowej, które następnie wspólnie przenosi się do 10 cm naczynia hodowlanego zawierającego pięć mililitrów soli fizjologicznej w buforze fosforanowym.

Przenieś pływające przekroje do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Gdy przekroje opadną na dno probówki, odessaw próżniowo fosforan buforowany roztwór soli. Zachowaj ostrożność, aby nie odessać preparatów.

Przerzuć sekcje do 10 mililitrów świeżego buforu, aby wypłukać pozostałości utrwalacza lub materiału zatopiającego. Natychmiast przenieś tę resuspensję pipetą do 15-mililitrowej probówki stożkowej, upewniając się, że wszystkie pływające sekcje zostały pobrane; odessij roztwór płuczący za pomocą próżni, a następnie poddaj sekcje perforacji w roztworze 0,3% Triton X 100 w buforze fosoranowym (PBS), umieszczając probówkę na platformie kołyszącej na 10 minut. W temperaturze pokojowej można następnie przejść do standardowego protokołu immunobarwienia w tej samej probówce stożkowej, powtarzając etapy odsysania próżniowego i kołysania zgodnie z potrzebami dla naczynia tej wielkości, zachowując objętość 10 mililitrów do etapów barwienia i płukania.

Poniżej znajduje się lista przeciwciał, których używamy do wspólnego barwienia pozytywnie przetransdukowanych neuronów sensorycznych węchu oraz ogólnej populacji neuronów sensorycznych węchu. Aby zapewnić dokładną penetrację przeciwciał w 60 mikronowych przekrojach cebulki węchowej, zaleca się inkubację przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Każdy etap płukania powinien trwać nie krócej niż 20 minut.

Każdą sekcję delikatnie rozprzestrzeniaj na szkiełku przedmiotowym za pomocą pędzelka, a następnie zamontuj każde szkiełko, stosując flora Mount G z dodatkiem roztworu barwiącego chromatynę. Dołóż starań, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza z medium montażowego. Umieść sekcje w rzędach, aby ułatwić późniejszy etap przesiewania.

Przeskanuj te warstwy na swoich sekcjach cebulki immunobarwionych w poszukiwaniu włókien aksonalnych i zakończeń pozytywnych pod kątem GFP. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego można następnie obrazować pozytywnie zainfekowane zakończenia nerwowe przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Pomocne jest skalibrowanie płaszczyzny ogniskowania w obszarze zainteresowania, wykorzystując kanały DPI oraz białka markerowego węchowego.

Wyniki te przedstawiają pojedyncze włókno aksonalne neuronu sensorycznego węchowego oraz zakończenie aksonalne w obrębie kłębka; zaznaczono białko markerowe węchu w kolorze czerwonym oraz vlu two w kolorze szarym. Ciała komórek zainfekowanych neuronów sensorycznych węchowych oraz ich kolbki dendrytyczne można również zwizualizować w obrębie nabłonka węchowego, jeśli tkanka ta została uwzględniona w etapach sekcji i immunobarwienia. Ta projekcja konfokalna dostarcza bardzo szczegółowego obrazu morfologii ścieżki rozgałęzienia aksonalnego i drzewa końcowego pojedynczego neuronu sensorycznego węchowego. Można zauważyć zawijanie się włókna aksonalnego z powrotem w kierunku docelowego kłębka, a także szczegóły wzoru jego rozgałęzień w neuropilu kłębka.

Metoda mikroiniekcji lentiwirusowej umożliwia wizualizację aksonów pojedynczych komórek oraz morfologii neuronów sensorycznych węchowych i pozwala na prowadzenie badań manipulujących ekspresją genów; transdukcja lentiwirusowa prowadzi do stabilnej integracji konstruktów z genomem. Lentiwirus nie infekuje transsynaptycznie sąsiednich komórek. Wizualizację można osiągnąć w czasie zaledwie trzech dni, a potwierdzono, że efekt ten utrzymuje się co najmniej przez trzy miesiące i prawdopodobnie trwa przez dłuższy czas.

Neurony sensoryczne węchowe nie są łatwo infekowane poprzez podanie roztworu lentiwirusa do jamy nosowej. W związku z tym w tej procedurze wymagane jest mikro wstrzyknięcie przez powierzchnię. To była nasza procedura mikro wstrzykiwania lentiwirusa.

Mam nadzieję, że wszystkie te informacje okażą się pomocne w uzyskaniu własnych morfologii pojedynczych komórek. Powodzenia w badaniach.