Analiza odpowiedzi neuronów sensorycznych węchu myszy z wykorzystaniem zapisu elektroolfaktogramu w fazie gazowej

Preparat nabłonka węchowego zamocowano na szalce i umieszczono w strumieniu nawilżonego powietrza. Pod mikroskopem stereoskopowym elektrodę referencyjną połączono elektrycznie z tkanką poprzez roztwór buforowy. Elektrodę rejestrującą umieszczono na powierzchni nabłonka węchowego.

Nabłonek węchowy jest stymulowany za pomocą kontrolowanych komputerowo puf odorantów podawanych w strumieniu nawilżonego powietrza, które transportuje substancje zapachowe do nabłonka węchowego. Sygnały EOG są przesyłane przez wzmacniacz i digytyzator do komputera rejestrującego. Witam, jestem Catherine Ciar z Laboratorium Higieny XO w Katedrze Biologii na Uniwersytecie Johns Hopkins.

Dzisiaj przedstawimy procedurę rejestracji elektroolfaktogramu u myszy. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania reakcji neuronów sensorycznych węchu na zapachy. Zacznijmy zatem.

Aparatura rejestrująca składa się z elektrody rejestrującej, elektrody odniesienia, rurki doprowadzającej powietrze, stolika z preparatem oraz mikroskopu sekcyjnego, z których wszystkie są zamocowane na stole pneumatycznym wewnątrz klatki Faradaya. Do rozmieszczenia elektrod w rurce doprowadzającej powietrze wykorzystuje się mikromanipulatory. Ciągły strumień powietrza jest przepuszczany przez wodę destylowaną w celu nawilżenia, a następnie kierowany przez rurkę doprowadzającą powietrze nad preparat.

Jako powierzchnia montażowa dla preparatu wykorzystuje się szalkę hodowlaną o średnicy 60 mm wypełnioną agarem o grubości od sześciu do ośmiu milimetrów. W agarze w szalce montażowej wydrążono otwór oraz kanał. Służą one do zapewnienia połączenia elektrycznego między elektrodą odniesienia a preparatem za pomocą zmodyfikowanego roztworu Ringera.

Elektrody rejestrujące i referencyjne są podłączone do wzmacniacza. Sygnały z wzmacniacza są przesyłane do digitalizatora, a następnie do komputera. Oprogramowanie XI graph służy do sterowania protokołem stymulacji, rejestrowania sygnału oraz analizy odpowiedzi.

Oscyloskop jest podłączony za wzmacniaczem w celu monitorowania potencjału elektrycznego w czasie rzeczywistym podczas umieszczania elektrody rejestrującej, a także podczas rejestracji EOG. Podawanie bodźców zapachowych jest sterowane za pomocą picospritzera, który jest podłączony do tego samego komputera, który służy do akwizycji sygnału bezpośrednio przed podaniem bodźca zapachowego.

Wyjście rozpylacza pico jest połączone z butelką z substancją zapachową zawierającą ciekły odorant. Butelka ta jest następnie połączona z rurką doprowadzającą powietrze. Przejdźmy teraz do sposobu przygotowania elektrod do eksperymentów rejestracyjnych.

Elektrodą rejestrującą jest drut srebrowy z chlorkiem srebra w dociąganej kapilarze szklanej wypełnionej zmodyfikowanym roztworem Ringera. Elektrodą odniesienia jest drut srebrowy z chlorkiem srebra. Przygotowanie obu elektrod należy rozpocząć od zamontowania drutu srebrowego w uchwycie elektrody.

W przypadku elektrody pomiarowej z końca uchwytnika elektrody powinien wystawać jeden do dwóch centymetrów drutu. W przypadku elektrody odniesienia można pozostawić więcej drutu. Aby nanieść powłokę z chlorku srebra, należy umieścić drut w 0,1 molarnym roztworze chlorku sodu i podłączyć uchwytnik elektrody do bieguna dodatniego źródła prądu stałego o napięciu od 1,5 do dziewięciu woltów.

Ujemny biegun źródła zasilania należy połączyć elektrycznie z 0,1 M roztworem chlorku sodu. Pozostawić układ w reakcji przez 10 minut, aby wyrównać ładunki statyczne między elektrodą pomiarową a elektrodą odniesienia. Przed zamontowaniem elektrod w aparaturze pomiarowej należy je krótko ze sobą zetknąć.

Następnie wyprowadź szklaną kapilarę za pomocą mikro-wyciągacza pipet. Otwór na końcówce kapilary powinien mieć średnicę około pięciu do 10 mikronów. Użyj rysika diamentowego, aby naciąć i odłamać tępy koniec kapilary, tak aby była ona o około dwa centymetry dłuższa od srebrnego drutu.

Użyj palnika butanowego, aby wypolerować ogniowo cięty koniec, a następnie roztop 0,5% agros w zmodyfikowanym roztworze Ringera. Za pomocą pipety transferowej pobierz niewielką ilość stopionego roztworu agros do końcówki elektrody, używając strzykawki, która została podgrzana i wyciągnięta, aby uzyskać długi, cienki koniec. Wypełnij wyciągniętą kapilarę mniej więcej do połowy.

Używając zmodyfikowanego roztworu Ringera, delikatnie stuknij kapilarę, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Przechowuj wypełnioną elektrodę w słoiku do przechowywania z niewielką ilością zmodyfikowanego roztworu Ringera na dnie, aż do momentu użycia. Po przygotowaniu próbki tkanki do rejestracji, zamontuj wypełnioną kapilarę na przewodzie elektrody rejestrującej wraz z przygotowanymi elektrodami.

Przeanalizujmy eksperyment rejestracyjny w celu rozpoczęcia przygotowania tkanki do pomiarów. Usuń skórę pokrywającą czaszkę uśpionej myszy i przedziel głowę na pół wzdłuż linii środkowej, a następnie zamocuj jedną z połówek głową stroną przyśrodkową do góry na podkładce montażowej. Ostrożnie usuń przegrodę nosową, aby odsłonić błonia przeciwnose.

Umieść płytkę z zamocowaną tkanką na stole rejestracyjnym. Ustaw stół tak, aby miejsce rejestracji na błoniach nosowych znajdowało się w centrum pola widzenia mikroskopu. Następnie otwórz zawór butli z powietrzem, aby dostarczyć nawilżone powietrze z przepływem około 600 milliliters per minute na powierzchnię błoni nosowych.

Umieść rurkę doprowadzającą powietrze w odległości około 10 milimetrów od miejsca rejestracji. Ustaw wzmacniacz w trybie DC, ponieważ wzmacnianie AC wywoła artefakty w sygnale EOG. Rejestrację przeprowadź z zastosowaniem filtra dolnoprzepustowego o częstotliwości 1 kHz i wzmocnieniu 100 x.

Teraz zamocuj elektrody rejestrujące i referencyjną na mikromanipulatorach. Opuść elektrodę referencyjną do otworu w naczyniu montażowym i przykryj ją zmodyfikowanym roztworem Ringera w taki sposób, aby była ona elektrycznie połączona z tkanką. Ostrożnie opuść elektrodę rejestrującą na powierzchnię małżowiny nosowej 2B lub 3.

Elektroda powinna ledwo dotykać powierzchni nabłonka węchowego. Gdy elektroda zetknie się z nabłonkiem, na oscyloskopie pojawi się prosta linia bazowa. Teraz podłącz buteleczkę z substancją zapachową do bocznego portu w rurce doprowadzającej powietrze w komputerze.

Rozpocznij protokół stymulacji. Częstotliwość próbkowania podczas akwizycji danych powinna wynosić 2 kHz lub więcej. Oprogramowanie wyzwoli impuls zapachowy i rozpocznie rejestrację.

Typowy protokół stymulacji może obejmować pojedyncze sparowane impulsy o czasie trwania 100 ms, oddzielone od siebie odstępem jednej sekundy, lub pojedynczy impuls o czasie trwania 100 ms, albo impuls podtrzymywany przez 10 s. Aby zminimalizować adaptację, należy zachować od jednej do pięciu minut przerwy między protokołami po podaniu wysokich stężeń zapachów. W rurce mogą pozostać resztki zapachu; przed przystąpieniem do analizy kolejnych próbek tkanek należy przemyć rurkę doprowadzającą powietrze 95% etanolem i wysuszyć ją.

Oprogramowanie Axo graft udostępnia narzędzia do pomiaru kluczowych parametrów sygnału EOG. Parametry te obejmują amplitudę odpowiedzi, latencję, czas do osiągnięcia szczytu oraz stałe czasowe wygaszania. Kilka parametrów EOG jest szczególnie użytecznych do porównywania znormalizowanych odpowiedzi między myszami, w tym amplituda odpowiedzi, czas narastania latencji, czas do osiągnięcia szczytu oraz stała czasowa wygaszania.

Przedstawiono tutaj OGs myszy w odpowiedzi na stymulację rosnącymi stężeniami ciekłego octanu amylu. Czarna linia u góry wskazuje czas i czas trwania stymulacji substancją zapachową. Widoczna jest tutaj zależność dawka-odpowiedź uśredniona z pięciu myszy; słupki błędów reprezentują 95% przedziały ufności.

Spadek amplitudy szczytowej jest często obserwowany przy bardzo wysokich stężeniach zapachów. Przykład EOG w odpowiedzi na stymulację podwójnym impulsem pokazuje, że pojedynczy krótki impuls substancji zapachowej wywołuje adaptację trwającą kilka sekund. Przedstawiono tutaj EOG w odpowiedzi na 10 sekund ciągłej stymulacji substancją zapachową.

Elektro-olfaktogram (EOG) wykazuje desensytyzację podczas ciągłej prezentacji substancji zapachowej. Przedstawiliśmy właśnie sposób rejestracji elektro-olfaktogramu u myszy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby umieścić elektrodę bezpośrednio na powierzchni nabłonka i nie wprowadzać jej pod tę powierzchnię.

Zawsze rejestruj sygnały z tej samej strony głowy i unikaj modyfikacji konfiguracji aparatury, aby zminimalizować zmienność. Utrzymuj tkankę w stanie wilgotnym, unikając jednak gromadzenia się kropel cieczy; umieszczenie tkanki w nawilżonym powietrzu bezpośrednio po sekcji pozwoli zachować ją w optymalnym stanie do rejestracji. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w eksperymentach.