Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie linii komórkowych do produkcji leków biologicznych, charakteryzujących się klonalnością oraz wysoką wydajnością. Osiąga się to najpierw poprzez transfekcję komórki gospodarza DNA kodującym gen zainteresowania. Kolejnym krokiem procedury jest izolacja wysokowydajnych klonów za pomocą FACS, a następnie dokumentacja tworzenia kolonii przy użyciu systemu CloneSelect Imager.

Ostatnim krokiem jest przesiewanie i wybór wysoko wydajnych klonów. Ostatecznie, za pomocą HPLC w fazie odwróconej, można uzyskać wyniki wykazujące produkcję przeciwciał w hodowlach ciągłych i fed-batch. Prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy sortowania i pcan 80 dgl są trudne do opanowania ze względu na złożoność konfiguracji wymaganej w tych procedurach. Następujący naukowcy z laboratorium zaprezentują te procedury: Jason Sanders zademonstruje transfekcję komórek gospodarza oraz sortowanie w celu dokumentacji tworzenia kolonii, a Russell Kan pobieranie próbek za pomocą systemu Tecan.

Aby rozpocząć tę procedurę, jeden dzień przed transfekcją wysiać komórki gospodarza do kolby hodowlanej w 15 mililitrach pożywki wzrostowej. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 7,5% dwutlenku węgla. Następnego dnia przygotować kompleksy transfekcyjne: najpierw rozpuścić 8 µg DNA w 800 µl pożywki wzrostowej bez surowicy w sterylnej probówce do mikrocentryfugi i delikatnie wymieszać. Następnie rozcieńczyć 40 µl lipofektaminy w 800 µl pożywki wzrostowej bez surowicy w probówce polistyrenowej.

Dodaj rozcieńczone DNA do rozcieńczonej Lipofectaminy. Wymieszaj delikatnie i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby przygotować komórki gospodarza do transfekcji. Usuń pożywkę wzrostową z komórek i zastąp ją 6,4 milliliters pożywki wzrostowej bez surowicy.

Do kolby dodać 1,6 milliliters kompleksów transfekcyjnych. Wymieszać delikatnie, kołysząc kolbą. Inkubować komórki w temperaturze 37 degrees Celsius w inkubatorze z dwutlenkiem węgla przez sześć godzin.

Po sześciu godzinach do kolby należy dodać osiem mililitrów pożywki wzrostowej i inkubować w inkubatorze z dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia pożywkę należy usunąć poprzez aspirację i dodać do kolby świeżą pożywkę wzrostową. Po tej inkubacji komórki należy ponownie inkubować przez noc.

Zastąp pożywkę wzrostową pożywką selekcyjną. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C w inkubatorze z dwutlenkiem węgla przez dwa do trzech tygodni. Dwa do trzech tygodni po transfekcji komórki są gotowe do klonowania za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Oddziel komórki z kolby i wiruj przy 800 RPM przez pięć minut w temperaturze 4°C.

Resuspenduj komórki w medium selekcyjnym uzupełnionym o 2% bovine serum albumin. Następnie dodaj przeciwciało anty-human IgG znakowane fluorescencyjnie. Dodaj rozcieńczenie w stosunku 1:20, inkubuj na lodzie od 15 do 30 minut, a następnie przemyj dwukrotnie zimnym PBS i resuspenduj komórki w 1 XPBS w probówce polipropylenowej.

Przykład zabarwionych komórek przedstawiono na tym zdjęciu; w celu przeprowadzenia aseptycznej sortowania na urządzeniu BD FACS Aria, należy przygotować 96-dołkową płytkę do hodowli komórek zawierającą 200 µL medium selekcyjnego w każdym dołku. Aseptycznie załadować probówkę z komórkami i przeanalizować je na urządzeniu BD FACS Aria, a następnie zapisać wyniki odpowiednio dla komórek zabarwionych i niezabarwionych.

Ustaw bramki i parametry w celu posortowania pojedynczych komórek o pożądanym profilu barwienia fluorescencyjnego do płytki 96-dołkowej. Inkubuj płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez dwa tygodnie. W dniu 0, 3, 7 i 13 po sortowaniu udokumentuj tworzenie kolonii w płytce 96-dołkowej za pomocą obrazownika do selekcji klonów, aby zapewnić wybór klonów pochodzących z pojedynczej komórki w celu przesiewania i selekcji klonów o wysokiej produktywności. Najpierw udokumentuj pozycję próbki w odbiorczej 96-dołkowej płytce analitycznej. Następnie użyj zrobotyzowanego systemu do obsługi cieczy, aby przenieść alikwoty 20 µL supernatantu do każdego dołka 96-dołkowej płytki analitycznej. Produkcję przeciwciał w próbkach analizuje się za pomocą testu kanapkowego.

Wykrywanie ludzkiego IgG metodą ELI SA za pomocą systemu do manipulacji cieczami w następujący sposób. Najpierw próbki i wzorzec nanosi się na wcześniej zakodowane płytki do analizy bio coat przeciwko ludzkiemu IgG. Płytki inkubuje się w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie wykonuje trzy płukania w PBS.

Następnie do płytek dodaje się przeciwciała kozie anty-ludzkie IgG z koniugatem HRP w rozcieńczeniu 1:2000 i inkubuje je przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie płytki przemywa się trzykrotnie PBS, a następnie dodaje substrat TMB.

Na koniec płytki odczytuje się za pomocą czytnika płytek, wykorzystując absorbancję przy 405 nanometrach do detekcji. Dzięki zastosowaniu tej zautomatyzowanej platformy stwierdzono, że poziom przeciwciał powierzchniowych, określony poprzez barwienie przeciwciałami anty-ludzkimi IgG znakowanymi fluorescencyjnie, koreluje z produktywnością przeciwciał komórki. Jak pokazano tutaj dla dwóch najlepszych klonów wygenerowanych z populacji komórek o wysokiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych, produktywność specyficzna wynosiła od 50 do 70 picogramów na komórkę na dzień.

W przeciwieństwie do tego, produktywność przeciwciał wynosiła około 20 picogramów na komórkę na dzień dla dwóch najlepszych klonów uzyskanych z populacji komórek o niskiej ekspresji przeciwciał powierzchniowych. Ponadto linie komórkowe opracowane metodą sortowania FACS są bardziej stabilne pod względem produkcji przeciwciał niż te, które zostały wyklonowane poprzez manualne rozcieńczanie ograniczające. Specyficzna produktywność najlepszego klonu (klon jeden) uzyskanego poprzez manualne rozcieńczanie ograniczające spadła z około 30 PCD do około 10 PCD po hodowli przez 80 podwojeń komórek.

Z drugiej strony, najlepszy subklon uzyskany poprzez sortowanie FACS z klonu dwa był w stanie utrzymać wydajność specyficzną na poziomie około 20 PCD przez co najmniej 100 podwojeń komórek. Identyfikacja miejsca integracji transgenu w chromosomie komórkowym za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ wykazała, że klon jeden jest mieszaną populacją fenotypu A i fenotypu B. W przeciwieństwie do niego, klon sortowany metodą FACS okazał się populacją bardziej jednorodną, w której 99,5% komórek miało fenotyp A. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat opracowywania linii komórkowych do produkcji białek terapeutycznych.