Wizualizacja rekombinowanego DNA i kompleksów białkowych przy użyciu mikroskopii sił atomowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest obrazowanie biomolekuł, takich jak DNA i białka, w buforach wodnych w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii sił atomowych. W tym celu najpierw przygotowuje się biomolekuły do obrazowania. Następnie konfiguruje się mikroskop sił atomowych i pozycjonuje sondę z dźwignią FM.

Następnie obrazuje się i analizuje powierzchnię próbki oraz interesujące biomolekuły. W efekcie, dzięki mikroskopii sił atomowych, można uzyskać wyniki ukazujące ogólną wielkość, ilość i organizację DNA oraz białek, a także heterogeniczne kompleksy biomolekularne w warunkach buforowych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny chaperonów molekularnych, takie jak geometria STO kompleksu chaperonów i koperonów z klientem.

Wizualna demonstracja tej metody jest korzystna, ponieważ etapy przygotowania sondy AFM i dźwigni Kent mogą być trudne do opanowania na podstawie instrukcji drukowanych, głównie ze względu na zawiłości związane z ich fizyczną manipulacją. Procedurę zaprezentują Morgan Shannon i John Gertz, dwaj studenci z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, należy wyizolować cząsteczki białka lub DNA przeznaczone do obrazowania i zawiesić je w buforze wodnym. Po potwierdzeniu czystości próbki, należy inkubować ją w buforze absorpcyjnym AFM w lodzie, aby wspomóc przyleganie próbki do miki.

W przypadku próbek białek należy zastosować bufor HEPS o stężeniu 10 mM. W przypadku DNA odpowiedni do montażu sondy AFM będzie bufor zawierający magnez, składający się z 10 mM Tris (pH 7,5), 10 mM chlorku sodu oraz 2 mM chlorku magnezu. Umieść uchwyt sondy celi przepływowej w odpowiadającej mu stacji dokującej do instalacji wspornika.

Zlokalizuj długi, gruby wspornik azotekowej sondy ostrej, która zostanie użyta do obrazowania. Ostrożnie przenieś ją do uchwytu sondy celi ciekłej, upewniając się, że końcówka pozostaje w pozycji pionowej. Następnie obejrzyj wspornik pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że jest on nieuszkodzony i prawidłowo osadzony w uchwycie sondy celi ciekłej.

Następnie ostrożnie zdejmij głowicę a FM z zespołu jaskółczego instrumentu, poluzowując śrubę zaciskową głowicy neuralnej. Odwróć głowicę a FM i mocno dociśnij uchwyt sondy celi przepływowej do czterech pinów u podstawy głowicy a FM. Na koniec ostrożnie zamocuj głowicę a FM z powrotem w zespole jaskółczym instrumentu.

Aby dodatkowo przygotować FM przed obrazowaniem próbek, należy obrócić pokrętła wbudowanego mikroskopu świetlnego w celu zlokalizowania wierzchołka wspornika, a następnie za pomocą strzałek góra i dół w kontrolerze optyki w oprogramowaniu ustawić ostrość na wierzchołek wspornika. Należy użyć pokręteł regulacji lasera, aby wycelować wiązkę w wierzchołek wspornika. Jest to jeden z najtrudniejszych technicznie etapów protokołu; pozycjonowanie odbywa się ręcznie i wymaga precyzyjnej regulacji pokrętłami.

Uważne monitorowanie wiązki lasera w plamce odbicia oraz plamce oświetlenia zwiększa prawdopodobieństwo pomyślnego ustawienia. Następnie należy obrócić pokrętła fotodetektora w głowicy AFM, aby go wycentrować. Umieść świeżo złupaną płytkę miki przytwierdzoną do metalowego krążka na próbkę AFM na zmagnetyzowanym uchwycie próbek znajdującym się na płytce podstawy AFM.

Obróć płytkę uchwytu a FM tak, aby dysk z próbką był ustawiony do wstępnego obrazowania. Użyj funkcji sterowania powierzchnią ogniskowania w oprogramowaniu urządzenia, aby przesunąć głowicę a FM w dół, w kierunku powierzchni dysku MICA z próbką. Wybierz ikonę strojenia w oprogramowaniu urządzenia i nastroj dźwignię, aż wyraźne cechy powierzchni MICA lub odbicie z końcówki znajdą się w ogniskowej.

Częstotliwość rezonansowa zalecanych sond MSNL lub SNL wynosi od 20 do 60 kilohertz. W celu obrazowania próbki MICA należy wybrać 5% przesunięcia szczytu (peak offset). Najpierw należy wprowadzić sondę w kontakt z powierzchnią MICA, ustawiając początkowy rozmiar skanowania na 10 micrometers oraz szybkość skanowania na one hertz.

Wykonaj pełne obrazy skanowania pola o wielkości 10 µm. Następnie zmniejsz rozmiar skanowania do 5 µm oraz 0,5 µm i wykonaj pełne obrazy każdego z tych pól. Odłącz sondę, klikając raz ikonę odłączania w oprogramowaniu urządzenia.

Aby obrazować interesujące biomolekuły, wymieszaj 5 µL przygotowanej próbki z 45 µL świeżego buforu absorpcyjnego. Ostrożnie nanieś 50 µL roztworu zawierającego biomolekuły w stężeniu 0,5 µg/mL bezpośrednio na powierzchnię MICU. Odczekaj pięć minut, aby biomolekuły w próbce mogły przytwierdzić się do powierzchni miki.

Następnie pipetuj dodatkowe 50 do 100 µL buforu absorpcyjnego do uchwytu sondy w celi cieczowej. Uważając, aby nie dotknąć sondy, głowicy FM lub MICA końcówką pipety, ponownie ustaw fotodetektor i w razie potrzeby wyrównaj laser względem dźwigni. Następnie użyj oprogramowania instrumentu, aby ponownie zaangażować sondę.

Zwiększ rozmiar skanu, aby zidentyfikować obszary zainteresowania. Po zakończeniu obrazowania kilkukrotnie kliknij ikonę wycofania w oprogramowaniu urządzenia, aby odłączyć sondę. Na koniec użyj wody destylowanej, aby dokładnie wypłukać uchwyt sondy celi cieczowej oraz dysk z próbką.

Następnie należy spróbować z użyciem sprężonego powietrza. Tutaj przedstawiono przykład obrazu AFM. Podłoże z miki zapewnia powierzchniowo płaską strukturę na poziomie molekularnym, na której mogą adsorbować DNA i białka.

Obrazowanie MICA przed analizą próbek biomolekuł stanowi kontrolę negatywną oraz pozwala na ocenę szumu obrazowania. Zapewnia ono również pewność, że wspornik jest odpowiednio dostrojony, a późniejsze obrazowanie próbek przebiegnie pomyślnie. Dwuniciowe plazmowe DNA, prawdopodobnie superzwinięte, można łatwo zidentyfikować po asymetrycznym wyglądzie oraz jednolitym osadzaniu się na wcześniej niepozornym podłożu Micah.

Kompleksy białkowe o różnych rozmiarach cząstek są również w sposób unikalny rozróżnialne na podłożu Micah. Różnice w wielkości cząstek wskazują na heterogeniczność próbki i mogą być przydatne przy szacowaniu stechiometrii geometrii kompleksu białkowego lub jego aktywności biochemicznej. Zaobserwowano ogólny diagonalny kształt i spójną orientację cząstek białek.

Poniżej przedstawiono artefakt obrazowania, ponieważ białka powinny być zorientowane na podłożu z miki w sposób losowy. Możliwymi przyczynami zaobserwowanego artefaktu mogą być: fizyczna anomalia sondy lub obrazowanie AFM przy zbyt wysokiej prędkości skanowania, podczas gdy splot sondy uniemożliwia obliczenia bezwzględnych pomiarów długości w osiach X i Y; pomiary wysokości w osi Z oraz względne pomiary w osiach X i Y mogą być jednak użyteczne do szacowania właściwości biofizycznych obrazowanych biomolekuł. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o dokładnym dostrojeniu wspornika i wyrównaniu fotodetektora zgodnie z tą podstawową procedurą AFM.

Można dodać inne etapy, w tym zastosowanie komórki przepływowej do wymiany buforu, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zdolność chaperonów molekularnych do wpływania na uwalnianie receptorów steroidowych z ich elementów odpowiedzi DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo lepiej rozumieć, jak obrazować białka DNA i kompleksy biomolekularne przy użyciu mikroskopii sił atomowych w warunkach buforowych.