Rozwiązywanie praktycznych problemów związanych z mikrowgłębieniami opartymi na mikroskopii sił atomowych na eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej
28 października 2022
Przedstawiamy krok po kroku podejście do identyfikacji i rozwiązywania najczęstszych problemów związanych z mikrowgłębieniami mikroskopii sił atomowych. Ilustrujemy pojawiające się problemy na rodzimych eksplantatach ludzkiej chrząstki stawowej, charakteryzujących się różnym stopniem zwyrodnienia spowodowanego chorobą zwyrodnieniową stawów.
Celem tego protokołu było stworzenie modelu in vitro do badania właściwości mechanicznych chrząstki stawowej podczas wystąpienia i progresji choroby zwyrodnieniowej stawów. Główną zaletą obecnej techniki jest to, że eksplantaty chrząstki są łatwe do wygenerowania i wysoce reprezentatywne dla chrząstki w wieku rodzimym. Model ten może być używany do analizy i monitorowania różnych podejść do choroby zwyrodnieniowej stawów, diagnostycznych i terapeutycznych na poziomie biomechanicznym.
Na początek odetnij chrząstkę od kości za pomocą skalpela. Za pomocą stempla biopsyjnego wygeneruj dyski o średnicy czterech milimetrów. Umieść tarczę na specjalnie wykonanym urządzeniu tnącym.
Za pomocą szpatułki przymocuj i ustabilizuj krążek chrząstki. Przetnij krążek chrząstki żyletką. Za pomocą szpatułki zbierz krążek i umieść go w 1,5-mililitrowej tubce.
Aby pozostać w próbkach chrząstki, dodaj 130 mikrolitrów przepuszczalnego dla komórek barwnika fluorescencyjnego do każdego dołka 96-dołkowej płytki i rozprowadź krążek na płytce jako jeden krążek na studzienkę. Umieść 96-dołkową płytkę na uchwycie płytki mikroskopu fluorescencyjnego. Wybierz odpowiedni filtr fluorescencyjny i obiektyw.
Umieść obiektyw pod wstępnie wybraną studzienką zawierającą pojedynczą chrząstkę. Ustaw ostrość na dysku, aby zobaczyć wzorzec komórkowy. Wybierz funkcję nawigatora, aby uzyskać przegląd całej studni.
Użyj lewego przycisku myszy i przeciągnij go, aby przejść do innej pozycji sceny. Wybierz kwadrat obejmujący obszar zainteresowania, który ma zostać zeskanowany. Wybierz opcję punktu mapy ostrości oprogramowania, a następnie wybierz każdy pojedynczy kafelek, klikając lewym przyciskiem myszy w jego środku.
Wybierz opcję mapa fokusu w wyświetlonym oknie ze wszystkimi wcześniej wybranymi kafelkami. Kliknij dwukrotnie kafelek, aby go wyświetlić i ustawić na nim odpowiednią ostrość. Następnie kliknij ustaw Z, aby zapisać plan ogniskowej i przejść do następnego kafelka.
Po dostosowaniu planu ogniskowej dla każdej płytki z osobna rozpocznij akwizycję obrazu, naciskając przycisk rozpocznij skanowanie. Napraw każdy wstępnie wybrany krążek chrząstki zawierający wzór komórkowy na szalkach Petriego, dodając wystarczającą ilość biokompatybilnego kleju po górnej, dolnej, lewej i prawej stronie dysku. Przykryj krążki 2,5 mililitrem pożywki Leibovitz bez L-glutaminy.
Umieścić szalkę Petriego w uchwycie na próbkę urządzenia AFM. Aby skalibrować wspornik AFM, umieść go na powierzchni wspornika pustaka szklanego tak, aby spoczywał na wypolerowanej płaszczyźnie optycznej pośrodku pustaka szklanego. Opuszczaj wspornik w krokach co 100 mikrometrów za pomocą funkcji silnika krokowego, aż zostanie całkowicie zanurzony w medium.
Aby zidentyfikować pożądane miejsce pomiaru chrząstki, należy rozpocząć podejście skanera za pomocą wspornika na czystym obszarze wolnej próbki szalki Petriego. Następnie cofnij wspornik 1,5 milimetra od spodu płyty. Przełącz się z widoku jasnego pola na widok fluorescencji i wizualnie zidentyfikuj górną część dysku.
Przesuń uchwyt próbki AFM dokładnie dwa milimetry w kierunku środka dysku. Uruchom podejście skanera, aby dotrzeć do powierzchni krążka chrząstki i cofnąć wspornik o 100 mikrometrów. Aby wygenerować krzywą odległości siły, skoncentruj się na komórkach znajdujących się w żądanym miejscu pomiaru.
Kliknij przycisk uruchamiania, aby rozpocząć pomiary i uzyskać pięć krzywych odległości siły w każdym miejscu pomiaru. Zapisz krzywe po ich sprawdzeniu. Aby oszacować moduły Younga, korzystając z opcji otwórz partię krzywych spektroskopiowych, otwórz wygenerowane krzywe odległości siły, które mają być analizowane.
Wybierz model Hertz-fit, a następnie opcję dopasowania elastycznego. Następnie zwizualizuj i udokumentuj moduł Younga. Dostosuj za pomocą współczynnika Poissona wynoszącego 0,5 i odpowiedniego promienia końcówki wspornika.
Następnie sprawdź wzrokowo dopasowanie krzywej odległości siły, aby zapewnić poprawność. Aby określić głębokość wcięcia, otwórz każdą z wygenerowanych krzywych odległości siły w oprogramowaniu do analizy danych i wybierz model dopasowania Hertza jako proces analizy. Zastosuj opcję odejmij odsunięcie linii bazowej, aby wyzerować pionową oś odchylenia i wybierz funkcję odsunięcia plus pochylenie.
Użyj funkcji znajdź punkt kontaktowy, aby automatycznie zidentyfikować punkt kontaktowy. Korzystając z funkcji pionowego położenia końcówki, odejmij odległość, uwzględniając wyłącznie ugięcie wspornika od surowej wysokości piezoelektrycznego podczas wcięcia. Wybierz opcję dopasowania sprężystości, aby wyświetlić przetworzoną krzywą odległości siły.
Następnie wybierz obszar wykresu tak, aby pokrywał się z najbardziej ujemną wartością na pionowej osi położenia końcówki. Na karcie parametrów w polu XMIN odczytaj i udokumentuj wcięcie. Krążki zawierające pojedyncze struny wykazały wyższe wartości sztywności z medianą 2,6 kilo paskala, co jest reprezentatywne dla bezkompromisowych, zdrowych obszarów chrząstki.
Wraz z wystąpieniem i progresją choroby zwyrodnieniowej stawów, pomiary AFM wykazały silny stopniowy spadek sztywności o 42% w podwójnych strunach, 77% w małych skupiskach i ostatecznie o 88% w zaawansowanych stadiach reprezentowanych przez duże skupiska. Krążki zawierające wzór dyfuzyjny wykazywały podwyższoną elastyczność z istotną zmianą pojedynczych wartości modułu Younga. Dla wszystkich krążków chrzęstnych z przypisaną dominującą organizacją wzorca komórkowego stwierdzono, że głębokość wgłębienia związana z zastosowaną wartością zadaną jest odwrotnie proporcjonalna do sztywności.
Artefakty widoczne w wygenerowanych krzywych odległości siły wskazują albo na nieoptymalny kontakt między wspornikiem AFM a powierzchnią chrząstki, albo na niewłaściwe utrwalenie próbki na szalce Petriego. Nasze eksplantaty chrząstki mogą być dalej przetwarzane i analizowane przy użyciu różnych technik biologii molekularnej, takich jak analiza białek za pomocą elizy, znakowanie immunologiczne, modowanie zachodnie lub analiza genów za pomocą PCR. Metoda ta może być wykorzystana do zbadania bezpośredniego wpływu nowych terapii na chrzęstność stawową i może pomóc naukowcom w uzyskaniu ważnych informacji na temat mechanizmów choroby zwyrodnieniowej stawów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono protokół tworzenia modelu in vitro do badania właściwości mechanicznych chrząstki stawowej podczas postępu choroby zwyrodnieniowej stawów. Metoda opiera się na wykorzystaniu natywnych eksplantów ludzkiej chrząstki, które są łatwe do pozyskania i reprezentatywne dla zmian związanych z wiekiem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia
- Biomechanika
Wstęp
- Choroba zwyrodnieniowa stawów jest degeneracyjną chorobą stawów wpływającą na chrząstkę.
- Zrozumienie mechaniki chrząstki jest kluczowe dla opracowania strategii terapeutycznych.
- Obecne modele mogą nie oddawać dokładnie właściwości chrząstki natywnej.
- Niniejsze badanie ma na celu wypełnienie tych luk przy użyciu nowatorskiego podejścia in vitro.
Cel badania
- Stworzenie wiarygodnego modelu in vitro do badania mechaniki chrząstki.
- Ułatwienie analizy progresji choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Ocena podejść diagnostycznych i terapeutycznych na poziomie biomechanicznym.
Zastosowane metody
- Chrząstka zostaje oddzielona od kości za pomocą skalpela.
- Przy użyciu biotechnology punch wycina się krążki o średnicy czterech milimetrów.
- Krążki umieszcza się na specjalnie wykonanym urządzeniu tnącym w celu przeprowadzenia dalszej analizy.
- W celu oceny właściwości mechanicznych stosuje się mikroindentację za pomocą mikroskopii sił atomowych.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na skuteczne otrzymanie eksplantów chrząstki imitujących warunki naturalne.
- Właściwości mechaniczne chrząstki mogą być efektywnie monitorowane.
- Zidentyfikowano i omówiono problemy pojawiające się przy zastosowaniu tej techniki.
- Model ten dostarcza istotnych informacji w zakresie diagnostyki i terapii choroby zwyrodnieniowej stawów.
Wnioski
- Model in vitro jest cennym narzędziem do badania choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Umożliwia on badanie mechaniki chrząstki w kontrolowanym środowisku.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym modelu w celu eksploracji interwencji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mikroindentacja oparta na mikroskopii sił atomowych (AFM) na eksplantach ludzkiej chrząstki stawowej umożliwia precyzyjne profilowanie biomechaniczne, które jest kluczowe dla badań nad wczesną fazą choroby zwyrodnieniowej stawów. Eliminacja praktycznych artefaktów w procedurach AFM zwiększa pewność prognostyczną pomiarów właściwości mechanicznych, co wspiera rzetelną walidację celów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego na etapie odkrywania. Możliwość ta wzmacnia ciągłość translacyjną od fazy odkrywania po przedkliniczną ewaluację interwencji modyfikujących przebieg choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę właściwości mechanicznych chrząstki na różnych etapach choroby.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów terapeutycznych poprzez powiązanie zmian biomechanicznych z postępem choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez identyfikację artefaktów i zapewnienie integralności danych.
- Zwiększa pewność predykcyjną w procesie podejmowania decyzji dotyczących selekcji projektów w portfelu na wczesnym etapie.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia zwalidowane systemy ex vivo dla powtarzalnych analiz biomechanicznych.
- Standaryzuje przygotowanie próbek i protokoły AFM w celu zminimalizowania artefaktów pomiarowych.
- Dostarcza ilościowe wyniki modułu Younga i głębokości wgłębienia do oceny związków.
- Umożliwia wiarygodny screening kandydatów terapeutycznych ukierunkowanych na integralność chrząstki.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie odczytów biomechanicznych z modelami ludzkich tkanek istotnymi dla przebiegu choroby.
- Zapewnia ciągłość przejścia od wyników z etapu odkrywania do przedklinicznej walidacji wpływu terapeutycznego.
- Wspiera postępy skorygowane o ryzyko poprzez doprecyzowanie punktów końcowych mechanicznych w modelach choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Ułatwia integrację z analizami molekularnymi w celu opracowania kompleksowych strategii biomarkerów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół mikroindentacji oparty na AFM wpisuje się w kontinuum od wczesnych etapów odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów terapeutycznych oraz badania translacyjne w zakresie choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera ocenę mechanizmów degeneracji chrząstki opartą na hipotezach.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki biomechaniczne w celu przygotowania testów.
- Analityka: Dostarcza krzywe siła-odległość, moduł Younga oraz głębokość wgłębienia dla rzetelnego porównania statystycznego.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki ex vivo z przedkliniczną oceną interwencji terapeutycznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowany, powtarzalny schemat pracy dla biomechaniki chrząstki w programach badawczo-rozwojowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad chrząstką.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność analiz biomechanicznych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i optymalizuje alokację kapitału w portfelach projektów dotyczących choroby zwyrodnieniowej stawów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój kandydatów na leki modyfikujące przebieg choroby.
Kwestie dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w obsłudze AFM oraz w analizie danych biomechanicznych.
- Wymaga dostępu do skalibrowanego instrumentarium AFM oraz platform do obrazowania fluorescencyjnego.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja przygotowania próbek i przetwarzania danych pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla różnych źródeł chrząstki lub modeli chorobowych.
- Kluczowe jest zwrócenie uwagi na interakcję między próbką a końcówką oraz na fiksację, aby uniknąć artefaktów pomiarowych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
Tissue Processing and Generation of Cartilage Discs
1:14
Cartilage Disc Staining and Sorting
2:43
Biomechanical Approach of Cartilage Explants
6:11
Results: AFM Measurements of Cartilage Discs Based on Cellular Pattern Organization
7:25
Conclusion
