Komórkowy test wapniowy do przesiewowej analizy funkcji kanałów TRP o średniej i wysokiej przepustowości z wykorzystaniem systemu FlexStation 3

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zademonstrowanie zastosowania systemu FlexStation 3 do badania profilu farmakologicznego kanału potencjału przejściowego, znanego jako TRPA1. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez przygotowanie komórek wykazujących ekspresję kanałów TRPA1 w 96-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.

Po wypłukaniu komórek w myjce do mikropłytek, komórki są obciążane fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na wapń. Po okresie obciążania komórek następuje kilka dodatkowych etapów płukania. Kolejnym krokiem procedury jest przygotowanie płytki z substancjami, zawierającej agonistę TRPA1 oraz domniemany antagonista TRPA1.

W ostatnim kroku parametry oprogramowania są konfigurowane do odczytu płytek w systemie Flex Station three. Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące zależności dawka-odpowiedź dla aktywacji trip A one przez kwas flu fonemicowy oraz inhibicję przez związek antagonistyczny A. Chociaż metoda ta pozwala na poznanie mechanizmów aktywacji 21 poprzez pomiar napływu wapnia, może ona zostać zastosowana również do badania funkcji innych przepuszczalnych dla wapnia kanałów eye oraz białkowych receptorów sprzężonych z białkiem G przy użyciu barwników fluorescencyjnych wrażliwych na wapń lub barwników potencjału błonowego.

Główną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi technikami, takimi jak obrazowanie wapnia i manualne mapowanie patch-clamp, jest fakt, że ta oszczędzająca czas technika umożliwia wysokoprzepustowy screening funkcji i modulacji kanałów wapniowych, żelazowych oraz innych receptorów mobilizujących Ca. Przed rozpoczęciem protokołu należy wyhodować komórki HEK 293 stabilnie transfektowane trip A one do gęstości 70-90%, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Aby rozpocząć przygotowanie komórek do testu wapniowego, należy pokryć płytki 96-dołkowe, pipetując 50 µL poli-L-ornityny do każdego dołka, a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 15 minut.

Po inkubacji przemyć komórki raz roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym KO. Po trypsynizacji komórek HEC 2 93 przenieść pożądaną ilość komórek do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów i odwiruj próbkę. Odpiąć nadsącz i resuspender otrzymany osad komórkowy.

W pożywce DMEM uzupełnionej o 10% inaktywowanego serum płodowe cielęce odmierzyć 100 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Używając pipety wielokanałowej, pozostawić płytkę w komorze z laminarnym przepływem powietrza na co najmniej 30 minut przed umieszczeniem jej w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowej na 20 do 44 godzin. W celu przygotowania testu wapniowego najpierw sporządzić roztwory zgodnie z opisem w protokole pisemnym.

Po przygotowaniu zmieszano 10 µL 1 mM flu oh 4:00 AM z 10 µL onic. F1 27, a następnie całą zawartość przeniesiono do 5 mL buforu do analizy flu. Oh four uzupełnionego o 0,1% albuminy surowicy bydlęcej.

Następnie komórki hodowane na płytkach 96-dołkowych przemyć dwa razy roztworem HBSS w ilości 80 µL na dołek, używając myjki do mikropłytek. Po przemyciu, za pomocą pipety wielokanałowej, dodać 50 µL roztworu ładującego Fluo-4 na dołek i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Podczas godzinnego okresu ładowania komórek przygotować serię trzech roztworów agonistów w stężeniu 3x, serię trzech roztworów antagonisty w stężeniu 3x oraz dużą objętość agonisty o stężeniu 300 µM w buforze do analizy Fluo-4.

300 µL rozcieńczonych roztworów związków do płytki 96-dołkowej. W miarę możliwości należy zaplanować układ tak, aby rozcieńczenia seryjne związku oraz odpowiadające im kontrole pozytywne i negatywne znajdowały się w tej samej kolumnie płytki. Ponieważ stacja Flex trzy odczytuje jedną kolumnę na raz, w ostatnim etapie przygotowania komórek należy pipetować 300 µL roztworu agonisty o stężeniu 300 µM do dołka sąsiadującego z każdym dołkiem zawierającym antagonistę.

Przemyj załadowane komórki trzykrotnie buforem kwasowym fluo-4 za pomocą myjki do mikropłytek, pozostawiając bufor po ostatnim przemyciu. W każdej studzience powinno pozostać 80 µL buforu kwasowego fluo-4. Aby rozpocząć odczyt płytki, włącz system Flex Station 3 i uruchom oprogramowanie SoftMax Pro 5.2.

Zapisz eksperyment pod nową nazwą pliku w ustawieniach. Wybierz tryb flex i wprowadź parametry pomiaru efektu agonisty i antagonisty, zgodnie z listą w procedurze pisemnej. Następnie umieść nowe pudełko z końcówkami, płytkę związków oraz płytkę do odczytu w odpowiednich tackach stacji flex.Trzy.

Rozpocznij odczyt płytki, klikając przycisk read w oprogramowaniu Soft Max Pro. Urządzenie Flex Station three będzie odczytywać po jednej kolumnie na raz i dodawać związki w zaprogramowanych punktach czasowych bez przerywania procesu odczytu. Po zakończeniu pomiaru dane eksperymentalne można przetwarzać bezpośrednio w oprogramowaniu Soft Max PRO lub skopiować i wkleić do dowolnego programu arkusza kalkulacyjnego, takiego jak Microsoft Excel.

Aby przeanalizować dane, należy wygenerować krzywe zależności odpowiedzi od stężenia dla agonisty TRPA1 kwasu flupnemonowego oraz dla domniemanego związku antagonisty TRPA1, stosując metodę dopasowania najmniejszych kwadratów, zgodnie z opisem w procedurze pisemnej. TRPA1 jest kanałem kationowym przepuszczalnym dla wapnia, którego aktywacja prowadzi do napływu wapnia, który można wykryć za pomocą barwnika wrażliwego na wapń Fluo-4 AM. Reprezentatywne zapisy przebiegów czasowych zmian fluorescencji w odpowiedzi na szereg stężeń kwasu flupnemonowego (FFA) przedstawiono przy wyższych stężeniach. W przypadku wyższych stężeń FFA wzrost fluorescencji wywołany przez FFA charakteryzuje się znacznie szybszą kinetyką niż przy niższych stężeniach, pomimo podobnych poziomów fluorescencji szczytowej.

Aby wyróżnić te różnice, zależności stężeniowo-odpowiedzi zbudowano poprzez pomiar początkowych szybkości wzrostu fluorescencji. Po dodaniu różnych stężeń FFA ustalono, że połowa maksymalnego stężenia efektywnego FFA wynosi 55,4 micromolar. Przedstawiono również zależność stężeniowo-odpowiedzi hamowania wywołanej przez FFA odpowiedzi wapniowej przez domniemany antagonista TRPA1, związek A.

Dawka niezależnie zredukowała odpowiedź komórek trip A one na FFA z połowową maksymalną stężeniem hamującym wynoszącym 4,3 micromolar. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak badać profile farmakologiczne kanałów triple A one i pokrewnych przy użyciu stacji flag station three.