Kriokonserwacja embrionów myszy metodą witryfikacji z użyciem glikolu etylenowego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest kriokonserwacja embrionów myszy w ciekłym azocie oraz ich rozmrażanie w celu uzyskania żywych myszy. Jest to realizowane poprzez początkowe zanurzenie embrionów myszy w medium równoważącym, przeniesienie ich do medium do witryfikacji w probówce kriogenicznej, a następnie umieszczenie ich w zbiorniku z ciekłym azotem. Następnie embriony mogą zostać rozmrożone w medium o wysokiej osmolarności i inkubowane w medium hodowlanym aż do momentu ich przeniesienia do samic biorców.

Ostatecznie wyniki wykazują przeżywalność ponad 90% embrionów po rozmrożeniu z witryfikacji oraz wskaźnik urodzeń na poziomie od 30 do 70% po transferze embrionów. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że przenikalny krioprotektant glikol jest mniej toksyczny dla embrionów niż konwencjonalny krioprotektant. Przed rozpoczęciem niniejszego protokołu procedurę zademonstruje technik z mojego laboratorium.

Przygotować dwa dwukomórkowe embriony mysie w hodowli, uzyskane poprzez kojenie naturalne lub konwencjonalne techniki IVF, przenosząc je do probówki kriogenicznej w celu późniejszego przechowywania, a następnie dodać 50 µL roztworu do zamrażania embrionów EF S 40. Następnie przygotować plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm lub 60 mm z 50 µL roztworu EFS 20 w temperaturze pokojowej.

Za pomocą szklanej kapilary przenieś do szalki do 30 embrionów. Należy uważać, aby nie przenieść pożywki hodowlanej. Aby zapobiec odwodnieniu embrionów, umieść je na dnie kropli.

Po około 60 do 90 sekundach, używając kapilary, pobierz odwodnione embriony o skurczonej morfologii. Przenieś te embriony do roztworu EFS w probówce kriogenicznej, przenosząc jak najmniejszą ilość EFS 20.

Po przeniesieniu embrionów należy pozwolić im osiąść w EFS 40 przez jedną minutę przed zamrożeniem ich w ciekłym azocie. Przed rozmrożeniem embrionów należy umieścić w naczyniu hodowlanym co najmniej dwie krople po 10 µL pożywki do hodowli embrionów o wysokiej osmolarności, takiej jak pożywka M 16. Następnie krople należy całkowicie przykryć olejem silikonowym lub mineralnym, a naczynie umieścić w inkubatorze z dwutlenkiem węgla do czasu użycia.

Następnie, w masce ochronnej i rękawicach kriogenicznych, podgrzej roztwór TS one do 37°C. Wyjmij embriony z pojemnika z ciekłym azotem. Następnie szybko otwórz probówkę kriogeniczną i wylej ciekły azot z powrotem do pojemnika lub do innego odpowiedniego naczynia.

Następnie odczekać 30 sekund. Teraz dodać 850 µL ciepłego roztworu TS one do probówki kriogenicznej. Delikatnie aspirować i wydmuchiwać roztwór około 10 razy, aby został równomiernie rozpuszczony.

Następnie przenieś całą objętość do plastikowej szalki Petriego o średnicy 60 mm lub na szkiełko zegarkowe i odczekaj trzy minuty, aż embriony wyrównają temperaturę do temperatury pokojowej, w której powinny pozostać przez resztę procedury. Nie należy używać urządzenia grzewczego.

Szybko obejrzyj embriony w szalce pod mikroskopem stereoskopowym, aby ocenić ich wygląd na początku tej inkubacji. Po około dwóch minutach inkubacji zatop embriony, delikatnie potrząsając szalką, aż medium rozprowadzi się po jej powierzchni. W ostatniej minucie inkubacji nanieś do szalki trzy oddzielne krople roztworu TS two o objętości 50 µL.

Po upływie trzech minut za pomocą stereomikroskopu należy potwierdzić, że embriony lekko się skurczyły. Jeśli embriony są nadal obrzęknięte, należy kontynuować inkubację przez kolejne jedną do trzech minut. Następnie należy pobrać embriony szklaną kapilarą i przenieść je do pierwszej kropli TS two.

Odczekaj trzy minuty i przenieś embriony do drugiej kropli, a następnie do trzeciej kropli. Na koniec wyjmij z inkubatora przygotowaną szalkę z pożywką dla embrionów i za pomocą szklanej kapilary przenieś embriony do pierwszej kropli pożywki.

W przypadku obserwacji pod stereoskopem, embriony powinny powoli odzyskać swoją prawidłową morfologię. Teraz należy umieścić szalkę z powrotem w inkubatorze na około 10 minut. Następnie należy wypłukać sacharozę przeniesioną z TS two.

Przenieś embriony do kolejnej kropli pożywki hodowlanej. Kontynuuj hodowlę embrionów w inkubatorze CO2 aż do ich transferu do uk. samic biorców. Po witryfikacji i regeneracji od 300 do 480 embrionów trzech różnych szczepów myszy, przeżywalność była bardzo wysoka.

Po rozmrożeniu odsetek embrionów o prawidłowej morfologii wynosił od 93 do 99%, a co najmniej 84% z tych embrionów rozwinęło się do stadium blastocyst. Należy pamiętać, że praca z ciekłym azotem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy zachować środki ostrożności, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu i zminimalizować ekspozycję na wycieki w bliskiej odległości. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać zasad bezpiecznego obchodzenia się z azotem.