Dlaczego mikroskopia TIRF usprawnia walidację celów w badaniach nad egzocytozą neuronalną?

Mikroskopia TIRF selektywnie wzbudza fluorofory znajdujące się w pobliżu błony plazmatycznej, co umożliwia bezpośrednią wizualizację zdarzeń fuzji pęcherzyków. Pozwala to na uzyskanie wglądu w mechanizmy działania celów regulujących egzocytozę, wspierając walidację funkcjonalną w modelach neuronalnych istotnych dla przebiegu chorób.

W jaki sposób izolacja błony plazmatycznej jako płaszczyzny obrazowania wspiera cele potoku odkrywczego?

Dzięki ograniczeniu wzbudzenia do fali ewanescentnej, TIRF izoluje zdarzenia zachodzące w pobliżu błony, redukując tło cytoplazmatyczne. Zwiększa to specyficzność analizy egzocytozy, umożliwiając uzyskanie wyraźniejszych wyników w przepływach pracy na etapie wczesnego odkrywania.

Jakie pomiary ilościowe umożliwia obrazowanie TIRF w trybie poklatkowym w analizie egzocytozy?

Obrazowanie poklatkowe w technice TIRF umożliwia pomiar częstotliwości, czasu trwania oraz rozkładu przestrzennego zdarzeń egzocytozy. Te ilościowe wyniki stanowią podstawę analizy kinetycznej oraz oceny wpływu związków w kampaniach przesiewowych.

Dlaczego replikacja i standaryzacja parametrów są istotne dla współpracy międzyfunkcyjnej w testach opartych na obrazowaniu?

Spójne parametry obrazowania i replikacja zapewniają niezawodność danych oraz ich porównywalność między różnymi użytkownikami i eksperymentami. Wspiera to standaryzowane wdrażanie testów w wielozespołowych projektach badawczych.

Jakie możliwości analizy statystycznej są wymagane do interpretacji danych egzocytozy uzyskanych metodą TIRF przed wdrożeniem metody?

Zespoły wymagają możliwości analizy częstotliwości, czasu wystąpienia i rozkładu zdarzeń przy użyciu odpowiednich testów statystycznych. Umożliwia to podejmowanie decyzji opartych na danych w zakresie modulacji celu lub efektów związków w modelach neuronalnych.

Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego odbicia wewnętrznego do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

0 wyświetleń • 3:54 min • June 17th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zacznij od naczynia ze szklanym dnem zawierającego embrionalne neurony korowe na etapie całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia lub mikroskopu TIRF.

Neurony te wyrażają wrażliwe na pH zielone białko fluorescencyjne lub marker pęcherzykowy znakowany GFP, który fluoryzuje w neutralnym pH zewnątrzkomórkowym, ale pozostaje niefluorescencyjny w kwaśnych pęcherzykach.

Po zespoleniu pęcherzyków z błoną plazmatyczną, wystawienie na zewnątrzkomórkowe pH indukuje fluorescencję, zaznaczając zdarzenie egzocytozy.

Wybierz obiektyw i ustaw współczynnik załamania światła tak, aby pasował do neuronu.

Skieruj wiązkę lasera pod kątem do szkła, co powoduje całkowite wewnętrzne odbicie i generuje falę ulotną. Fala ta selektywnie wzbudza markery GFP w pobliżu błony plazmatycznej.

Ustaw głębokość penetracji TIRF, aby wykluczyć znaczniki GFP powyżej pola ulotnego.

Po pierwsze, użyj szerokokątnego oświetlenia epifluorescencyjnego, aby zlokalizować neurony wyrażające GFP.

Następnie przełącz się na oświetlenie TIRF w celu wzbudzenia specyficznego dla błony.

Uzyskaj obrazy poklatkowe, aby zarejestrować zdarzenie fuzji pęcherzyków i uwidocznić egzocytozę.

Po skonfigurowaniu mikroskopu TIRF i próbki oraz znalezieniu neuronalnej płaszczyzny ogniskowej zgodnie z protokołem tekstowym, uruchom oprogramowanie lasera i połącz się z oprogramowaniem sterującym laserem. Ustaw oświetlenie na szerokie pole i wybierz obiektyw. Następnie ustaw współczynnik załamania światła próbki i dostosuj intensywność lasera, odznaczając TTL dla lasera 491.

Optymalizacja parametrów obrazowania jest ważna podczas obrazowania nienaruszonych pęcherzyków egzocytarnych dna, aby uniknąć dryftu ostrości i fototoksyczności przy jednoczesnym wytwarzaniu obrazów o wysokim stosunku sygnału do szumu, wystarczającym do analizy.

Ustaw suwak w pozycji 100, a następnie zmniejsz go z powrotem do wartości z zakresu od 20 do 40. Następnie ponownie sprawdź czas wygaśnięcia. Następnie ponownie skoncentruj się na próbce w oświetleniu światłem przechodzącym.

Następnie w oprogramowaniu do obrazowania wybierz oświetlenie laserowe 491 i otwórz migawkę. Umieść kondensator do góry nogami na stole optycznym, aby nie porysować obiektywu. Precyzyjnie wyreguluj ogniskową lasera na suficie.

A po wyjęciu skraplacza wyśrodkuj punkt do środka membrany zamkniętego pola. Następnie wymień skraplacz. W oprogramowaniu TIRF ustaw głębokość penetracji na 110 nanometrów. Następnie przełącz się z oświetlenia szerokokątnego na tryb oświetlenia TIRF w celu obrazowania.

Teraz, używając epifluorescencji szerokokątnej, znajdź komórki wyrażające floriny VAMP2 przez okulary. Następnie, aby zmniejszyć fotowybielanie i fototoksyczność, dostosuj parametry obrazowania, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu i zakres dynamiczny przy minimalnym czasie ekspozycji i intensywności lasera. Ustaw ciągły autofokus na komórkę. Następnie utwórz zestaw zdjęć poklatkowych, w którym akwizycja odbywa się co 0,5 sekundy przez 5 minut.